搜索
厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.PCR技术原理厦门艾德生物医药科技有限公司厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.•DNA的变性在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。•DNA的复性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。DNA的特性厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.•最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，不耐高温。•TaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。PCR的发展厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.•DNA样品的变性•引物的退火•引物的延伸普通PCR原理厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.PCR反应要素•缓冲液：起PCR反应的缓冲体系•Mg2+：Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少•dNTP：dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低•引物：引物是PCR特异性反应的关键•酶：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少•模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.•引物是PCR特异性反应的关键•PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度•理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增•设计原则引物长度、引物扩增跨度、引物G+C含量、TM值、引物的特异性、引物量引物厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.PCR反应条件–温度变性温度：双链DNA在90～95℃变性退火温度：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素延伸温度：延伸温度：一般选择在70～75℃之间–时间：时间过长会导致非特异性扩增–循环次数：循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.PCR结果的分析•普通PCR跑电泳分析•荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针Taqman探针MolecularBeacons分子信标蝎子引物探针双环探针厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.5’3’5’3’SGSGSGSGSG激发光发射光SYBR-GreenI染料厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.TaqMan探针厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.分子信标探针厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.英国DxS蝎子探针技术厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.中美艾德特异双扩增技术厦门艾德生物医药科技有限公司AmoyDiagnosticsCo.,LTD.谢谢！