第五章目的基因的制备1

第五章目的基因的制备目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，编码蛋白质（酶）的结构基因。外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因。经典原核克隆体系流程图核酸限制内切酶消化机械切割双链cDNA合成直接化学合成PCR扩增含目的基因片段的获得同聚物加尾法连接粘性末端连接平末端连接接头或衔接物分子重组噬菌体DNA的转染重组质粒的转化重组噬菌体DNA或柯斯质粒体外包装成噬菌体颗粒的转导目的基因序列测定体外重组导入宿主细胞筛选T-A克隆遗传标记检测结构分析筛选免疫学筛选核酸杂交筛选免疫印迹筛选转译筛选1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取1基因组DNA片断化1.1限制性内切核酸酶酶切法该法适于从简单基因组中分离目的基因，如质粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI酶切，可获得目的基因。特点：优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene1.2机械切割法1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取PCR，PolymeraseChainReaction（1）反应体系：含有目的基因或序列的DNA模板热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）一对脱氧寡核苷酸引物（primer）4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555（2）基本工作原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。（3）PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以合成一对与模板DNA互补的引物，利用PCR技术扩增出含目的基因的DNA片段。2利用PCR扩增目的基因局限性：必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。常规PCR扩增片段一般在lkb以内。未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型的PCR：套式PCR、反向PCR、不对称PCR、多重PCR、锚定PCR、长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR和原位PCR等。1）Nestedpcr（套式PCR）特点:需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版套式PCR通过内外引物进行两次扩增，大大提高了检测的敏感性2）反向PCR（InversePCR）基本原理：扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成DNA。已知序列未知序列未知序列连接酶3）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。高浓度引物低浓度引物•以其中的mRNA作为模板，以Oligo（dT）或随机引物或基因特异性为引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。•以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达4）RT-PCR:•提取组织或细胞中的总RNA5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物6）原位PCRa.将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上；b.加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶到载玻片上c.在原位PCR仪内进行PCR扩增、检测。d.可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片7）定量PCR：•荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取3化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列基因的化学合成20世纪70年代，Khorana提出，提出体外扩增DNA1922-）印度-美国化学家遗传密码的破译，获得1968年诺贝尔医学和生理学奖。3.1DNA合成仪的基本工作原理是：将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性载体上．该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应，形成二核苷酸分子通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次与另一个5’或3’保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成三核苷酸分子；再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上洗脱下来。3.2DNA片断的组装化学合成的DNA片断一般在200bp以内。3.2.1互补连接法1）互补配对预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。2）5’端磷酸化用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链3）连接酶连成完整双链3.2.2互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物化学合成法优缺点优点：准确性极高，合成速度较快缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个碱基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头或衔接物序列、较小基因的合成。对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列.因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取基因文库(genelibrary)：指某一生物类型全部基因的集合。以重组体形式出现。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。4基因文库技术分离目的基因基因文库构建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择及制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库基因文库技术分离目的基因----未知基因基因的克隆：获得含重组DNA的宿主细胞克隆基因的分离:从文库中分离出目的基因分离基因的鉴定:确定基因的结构及功能3）基因文库的类别基因组文库与cDNA文库基因组文库：指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。基因组文库分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA文库：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA克隆、转化、培养、鉴定cDNA文库基因组文库的概念和大小λ噬菌体基因组文库的构建4.1基因组文库构建基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。4.1基因组文库的构建☺一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的基因都在克隆子群体中。☺以某生物基因组约3106kb，酶切片段平均长度15kb。理论克隆数：基因组DNA总长DNA片段平均长度3106/15=21054.1.1基因组文库的大小实际克隆数：DNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数值。一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。文库理论克隆子数＝以上的例子，N值应是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3106）]1975年，L.Clark和J.Carbon的经验公式：文库实际克隆子数N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因组文库必需的克隆子数；P:文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值99％，即0.99ƒ:分离的DNA片段平均大小与基因组大小的比值。一个完全的基因文库必须含有3-10倍于最低重组体克隆数的克隆。N==91053106/15=2105基因组文库应具有的克隆子数连接克隆载体的选择质粒载体可承载15kbDNA片段载体23kbDNA片段Cosmid载体45kbDNA片段YAC文库4000kbBAC文库300kb基因组文库的概念和大小λ噬菌体基因组文库的构建4.1基因组文库构建1）载体的特点：λ噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。承载较大外源DNA，约23kb。有多种限制酶识别位点。4.1.2λ噬菌体基因组文库获得含目的基因的DNA片段与λ噬菌体载体重组重组DNA的包装转化受体菌2）构建λ噬菌体基因组文库的步骤重组克隆的挑选和保存目的基因DNA片段化方法：超声波处理限制性内切酶部分酶切A机械切割法（超声波处理）：优点：可获得较均一的随机片段，缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。B限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。优点：直接产生黏性末端，缺点：片段的随机性较差。载体的结构左臂：编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因右臂：复制起始点、转录启动区和其它必须基因左臂和右臂末端的Cos位点中央片段：不含必须基因基因文库Sau3AI或MboI密度梯度离心或电泳YAC基因组文库的构建过程脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取4.2cDNA基因文库的构建及目的基因分离4.2.1cDNA基因文库的概念cDNA文库：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。4.2.2cDNA基因文库的构建4.2.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系4.2.4cDNA克隆的优越性4.2.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。mRNA的提取•全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；•用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA•纯化①分离细胞总RNA，从中分离纯化mRNA；②合成cDNA的第一条链：a.oligo(dT)引导的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A