单克隆抗体

单克隆抗体——1984年诺贝尔奖生物031-王欢主要内容•一、获奖者简介•二、理论依据•三、发展过程•四、具体实验获奖者•丹麦科学家杰尼、德国科学家科勒、阿根廷科学家米尔斯坦因发现生产单克隆抗体的原理而共同获得诺贝尔生理学或医学奖。NielsK.Jerne•1911–94,British-Danish免疫学家,b.London.在theDanishStateSerumInstitute工作(1945–55),为世界卫生组织首席官员(1956–62).他发展“networktheory”解释人类免疫系统产生抗体对抗疾病的互动过程.(3.4.5)GeorgesJ.F.Kohler•1946–95,German免疫学家,Ph.D.Univ.ofFreiburg,1974.他和CesarMilstein(1974–76)在theLaboratoryofMolecularBiologyinCambridge,England.工作,在哪里他们发展一项技术藉由融合产生抗体的细胞和快速生长的细胞因而产生大量的单株抗体,这项产生抗体的技术被全世界广泛的接受.(3.4.5)CesarMilstein•1926–2002,Argentine免疫学家,Ph.D.CambridgeUniv.,1960.他和GeorgesKohler(1974–76)工作在theLaboratoryofMolecularBiologyinCambridge,England.他们制造单株抗体来对抗特殊的细胞.这项产生抗体的技术被全世界广泛的接受.(3.4.5)理论依据•抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，特称之为抗原决定基(antigenicdeterminant)；一个抗原分子上通常都有许多处抗原决定基，而每个决定基至少都可诱生出一种抗体；因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别对抗这些不同的决定基。•对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同或相似的抗原决定基，所产生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应；因此在检定此类抗原时，其专一性不很理想，常常会出现假阳性，也称为交叉反应性。同时又由于免疫动物的个别体质不同，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清效价的高低。•血清中的每一种抗体是由单一种B细胞所分泌产生，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定基反应，其专一性极高。大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单株抗体。•然而B细胞不易在培养基中生长，虽然有人一直努力，想找出在体外培养脾脏细胞的条件，但结果均不甚理想，因此上述想法不易达成。•癌细胞的生长不受控制，很容易在培养基中生长，有很多已经建立好的癌细胞株，其生长特性均已了解；若把癌细胞永续生长的特性，利用细胞融合法导入可生产有用抗体的B细胞中，则得到可在培养基中永久生长的B细胞株，此即融合瘤细胞株。发展过程1955年，NielsK.Jerne便提出著名的免疫天择论，指出每个人体内都具有大量各式各样的抗体；当外来抗原进入人体时便会选择最适合的抗体来反应（也就是结合），而此一新结合的抗原抗体分子，又会刺激人体生产更多同类型的抗体。换言之，抗原在免疫反应里的作用彷佛模板，可供人体打造大量相对应的抗体。这个说法推翻了早先学界流行的想法，奠下现代免疫学的理论基础，同时也成为Burnet（Macfarlance，1960年诺贝尔生理医学奖得主）的选殖（clone）理论的前导。•1974年春天，二十八岁GeorgesJean的刚从瑞士的巴塞尔免疫学院得到博士学位，他选择了由CesarMilstein负责的英国剑桥大学分子生物研究室，继续博士后研究。•GeorgesJean的博士论文是研究抗体的基因突变，而CesarMilstein则是一直从事抗体遗传学的研究，他与Cotto曾将大鼠（rat）与小鼠（mouse）的淋巴细胞融合在研究抗体的产生情形，他同时也探讨基因突变后抗体受到的影响。•1969年，NielsK.Jerne前往瑞士，担任巴塞尔免疫研究所所长。这段期间，它又把多年研究心得整理出两大理论，一是关于免疫细胞生成机制的诠释，另一个则是重要的网络理论（networktheory），而后者正是让他获得诺贝尔奖的主因。这两个重要的理论分别是在1971及1974年提出，从此改写免疫学理的基础。•1974年CesarMilstein建议，GeorgesJean针对P3抗体来筛选抗原。此时P3已培养成功，如能找到抗原将是研究抗体遗传学最好的实验工具了。但这是一件费时费力且十分单调的工作。•CesarMilstein和GeorgesJean的研究，正是利用这个警报系统来抗癌。他们培养出所谓的融合瘤（hybridoma），也就是让癌细胞与制造抗体的Ｂ细胞相融合。由于癌细胞在人工培养环境中可以不断生长，所以融合瘤也可以长生不老。于是，科学家可以藉由变换Ｂ细胞的种类，来制造想要的抗体，而且是不限量制造。又因为免疫系统具有内建的基因置换机制（gene-shufflingmechanism），能够变换组合出好几百万种抗体，每一种抗体都是专为识别、捕捉某特定蛋白质而量身订做的。因此，科学家可以针对会刺激血管朝肿瘤生长的因子，设计出相对的抑制剂做为药物。•本实验关键步骤是细胞的融合，具体步骤如下：a.小白鼠免疫及脾脏细胞：•1)小白鼠(BALB/c)先以目标抗原(如菌体)免疫，2)抗原需加佐剂(adjuvant,如TiterMax)制成乳剂，3)打入小鼠体内慢慢释出(免疫流程)，4)诱使B细胞成熟增殖并生产抗体，5)然后取出脾细胞(大多为B细胞)与6)骨髓癌细胞进行细胞融合。•2?)注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。也可以在电泳后，切出所要色带，胶体装入乳化针筒，加入佐剂直接制成乳剂，可有相当好的免疫效果。•3)有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。近来更流行以抗原的DNA种入肝脏中，以此DNA的表现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应还是最可靠。细胞融合：•小白鼠脾脏细胞B与NS-1细胞N以PEG进行融合，操作在10min内完成，随即把细胞平均分配在96槽细胞培养盘中。由于融合是随机的，故可能的组合有：B-N,B-B,N-N,B-B-B,B-B-N....；只有同时含有B与N的融合细胞才会活下去注意点•1)NS-1要健康，在T-80培养瓶内生长密度不要超过六成，一瓶T-80细胞用在一次融合。脾细胞取出后可以不用除去红血球，直接以RPMI洗三次，要小心自行调整离心力不致太大，也不能太小，随时镜检之。•2)要用可靠的PEG1500，可使用商品已配置好的溶液，每次0.7~1mL；否则自己要试出可用的批次，在高压灭菌时，尽量缩短灭菌时间(5min足够)，并且要尽速由灭菌釜内取出。•3)把NS-1与脾细胞混合，每次使用一个T-80与一个脾脏，几乎可以不用数细胞数目；在50mL离心管中，小心把细胞离心下来，倒去上清后，以残留的RPMI把细胞打散，放在37℃内保温准备加入PEG。•4)在2min内慢慢加入PEG，同时一边轻轻摇动，让PEG均匀地混合细胞。然后在2min内加入2mLRPMI，边加边混匀；再于2min内，再加8mLRPMI。此时镜检可看到许多细胞聚合，如上图的黑白照片；若在融合后1h内看不到很多融合细胞，可能已经失败。•5)离心去掉上清，轻轻加入30mLHAT-RPMI，并均匀悬浊细胞。此步骤最为关键，离心力不可过大，以免把融合后的脆弱细胞压成一块；若你无法轻易而均匀地把细胞悬浊，可能已经失败。•6)把细胞放在保温箱30min后，均分到三片96孔培养盘，每槽加约三至四滴，分配要平均。•7)从第二天起就不再用HAT，改用HT-RPMI即可。添加或换培养液时，不要扰动细胞，并且不要在培养相外面放置太久。第二或第三天镜检可以看到很多二元体，是融合后的第一次分裂；这种二元体数目应该很多，培养槽内到处都会冒出来(约25至50对)，可以用『雨后春笋』来形容之，否则可能已经失败。•8)但细胞仍然迅速死亡，最后每槽只剩下一或二个稳定细胞群落，约一周内可以看到如下面彩色图片所示的细胞堆，此时可以进行ELISA筛选。筛选方法•)初步筛选：融合后马上以HAT培养，能活下来的都是上述B细胞与NS-1的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未十分稳定。•2)筛选专一性抗体：并非所有B细胞都会产生我们所要的抗体，小白鼠原先就存在许多B细胞株对抗一般疾病；因此要用酶免疫分析法(ELISA)挑出专一性抗体。•3)单株化：这样所挑出来的细胞株，也许仍含有两群以上的细胞(为什么？)，因此要进行单株化；先将该细胞株稀释，重新平分到96槽细胞培养盘中，以计算使得每槽中只含有一个细胞，俟其生长成群落后，再次以ELISA筛选专一性抗体。抗体生产：•1)可把挑选出来的融合细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后收集所产生的腹水，腹水中的抗体浓度非常高，每mL可达数mg。•2)把融合细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每mL只得约数mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。•3)所得到的抗体再经纯化步骤，以除去杂质，可用下列各种方法的组合︰•1.硫酸铵分划：收集约40%饱和度的沉淀，是最经济、方便的方法。•2.离子交换法：用DEAE阴离子交换法，多用在纯化IgG。•3.胶体过滤法：以分子量的差异分划出各种抗体，多用在纯化IgM。•4.亲和层析法：以ProteinA-吸着剂专一性地吸住抗体分子(IgG)。