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目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞1、什么是目的基因？2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？一、目的基因的获取1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）基因文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部DNA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增基因文库的构建过程mRNA单链DNA双链DNA逆转录cDNA文库如何从基因文库中找到所需要的基因？依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：DNA复制PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板原料引物酶控制温度利用PCR技术扩增目的基因——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段——耐热的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：PCR的过程：利用PCR技术扩增目的基因变性(90-95℃)复性(55-60℃)延伸(70-75℃)用化学方法直接人工合成条件：基因较小，核苷酸序列已知。二、基因表达载体的构建—核心用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒二、基因表达载体的构建—核心二、基因表达载体的构建—核心目的基因二、基因表达载体的构建—核心1、基因表达载体的组成目的基因启动子:终止子:标记基因等一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。启动子的作用：二、基因表达载体的构建—核心终止子作用：使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。二、基因表达载体的构建—核心2、基因表达载体的构建目的：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因能够表达和发挥作用。三、目的基因导入受体细胞1、什么是转化？2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。三、目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞常用的方法:农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌的特点:a.易感染双子叶植物和祼子植物。b.具有趋化性。c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程:构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达２.目的基因导入动物细胞常用的方法:显微注射技术操作程序：三、目的基因导入受体细胞a.先提纯含目的基因的表达载体b.从动物体内取出卵(受精卵）c.显微注射仪进行显微注射d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体3.目的基因导入微生物细胞原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。大肠杆菌的转化过程:用Ca2+处理细胞增加细胞壁的透性，与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞→感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？1.目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上目的基因的检测内容和方法检测方法:DNA分子杂交技术DNA探针：用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。四、目的基因的检测与鉴定2.目的基因是否转录出mRNA目的基因的检测内容和方法检测方法:分子杂交技术用DNA探针与mRNA杂交。四、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测内容和方法检测方法:抗原—抗体杂交3.目的基因是否翻译出蛋白质四、目的基因的检测与鉴定4、个体生物学水平的鉴定四、目的基因的检测与鉴定β—珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的β—珠蛋白，想一想，应该如何设计？思考与探究思考与探究1.从小鼠中克隆出β—珠蛋白基因的编码序列（CDNA）。2.将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出了大肠杆菌菌落，则表明β—珠蛋白基因已进入。4.培养进入了β—珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β—珠蛋白。