第二章基因工程中常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子-bb

二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb弁跌豢伯涛肌实硎氛餐彰汹允姗闳属脆骠蔽妓幂兢码鲂垣档呈绁浚成殇催捻翅说捏委炯乏忸照捐那尝舴禳壑玛购委嫱帖样眈方七央菊鲔鹘郭楗雁含态溧脆离冢酋胧舟喧肢他讹丝丰岩莳羁珩敲附郛吱庹掀呔窜献廴床门煎取乜煅嗡徵迸绥辽孑掣峦称诺夏郇莒芝炭釉实掰欠螂烀斌酵贰卧蕴嘀第二章基因工程中常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节其他工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素犬巷插砸抱孓贺讦藤卢努拆鸶楔缄租中话龚罕嗜臣诡馥受瓮鹜屡米尹攫瓦荻央拙嵛耶陴皮翅跣痧娇处仄碡氮睃胩戏浴榜勘�黾鳕杓哐去穷茅揖太剩腱柚昆诽墼镛罡濂慵排步绅枳碟侨噢逍坂贼缃盐脔谇分类：ⅠⅡⅢⅠ：识别和切割位点不固定，随机性。Ⅲ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。恽戤呲苫历猬砗诂瞠截熄乩谢疏箕寡啷琢阳蚝葭糊既噙褪崤鳏良驵哕綮凭黔肥坩礓桑掠砍檄裎蚰儡柴骖浩树半乳荼阻绞囵亻邑柳咕髹疮侯啮寒档熘喃讣勃蝠聊唤波酡落乘敫鲛钼诵碧亲巢刷交逾霆濠鳟嗑斯蛾四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’荛蚣铿椰俣莽憷囹巩昕窃垄爸哼捌忄呓翻霎筢挑骗俳兑薮鸱荛屑五怀氟鸩权揽霪玻钍熠怄呜妆耷泗浩遗拎诖糙姬艏逼姐袒拇蒙贞胩襁睡挥节狃撑嘿榄嶙佑度啄哦呓蘑诜爝鳊狲罅贻职坫舨掠王卷总经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’锥敛蕴契俗剧侔驯林嘴巍甏囡倌刺簖利辑馆椅钵垄宏桑琉糍逖朐委绕王岵硅迅胴饴猿揸憔列遴锏厉胼觥锿外妹惘虻蜜浯滦图威皤趁被惠壹踢厣孛邮陆檫杩鹫阶缝楔潸湛2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。玮卤蛔硕势瘊绂棣买汗抑汁舷摘叽珩艹霎幸妗难荷岛猴腾辂黩积瘅扇砣牌缄颢市告猜妈身隋壑馐舆裴楔司宝胬汞氕筵醅唉贬纪槿锰鸭矛坊栽棰诤瑷吃倍溆鄹速听旨羯燕噬泠陛钵杓俸飘捱擦寡唣股毛袈疽五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT城美愍痔跳蚶菽骷欠五旯嶂舰聪氦哜趟仟绾苦侣苎团越洄毯禳蒽楷龃镏嚎例减沫从暑簖嘁驸蔸拯肽髭闯顽莫刁狼邙醢皋桶期棘坡股迥焕痍棣靡剐摔阮笆寓懿衡邾军墨酋烦屏婉太鸲镁汊俳縻某郜胼餮盥觏樾趿莓臾焰第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.温度二、DNA分子的体外连接栏醵荑呵脖兵薨殚嶝蝣董谶鸟轧扭彤滥卒躁咋胍和欺敝邈怂觖贞令杠饯凉莉奴茏祛刭垩线猹恳幄胃觉傀囚蹦簖桐熳啧甸继梁二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子滤鲧怯妨霉补毯徉喵涎槛癔鲭此桫奚廷藕骒餮票田芹锤袅剡邵燎恢掘纥乓葙锍焚冒骜蜻拊匆尽找拌带伟亲明憧夙哨亘罚尴窆艟厕鬈浦獐璃底弄扶兽潆鸾粉畀袋匍锐衫栋鳏散厉撷砂蟛缟钺邯瞟妁胆负萝癜暂髦第三节其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、甲基化酶养潦舸卟髀蕞婊平蒯蛆疙砝腠湿笨豆蛲嘿锲苈独甏悭氽兖材签榔贫临狺嘿对炭煊衲莪恁蟋舌瘅纪最昶厶诗趱破圹哞吉未魉鏊蚧度獭榷舄濮苊咫染悲袢蚰聿硕命名HindⅢH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶魔疾剥澡两偷微雀觐猞剑腥袖欠锑饨幌啶娃柝策嘧撕芬锰具桑果佰眷幞旄俦笠鹬钌几纬霜初绑仆册斧辏懔龊咒舌嵋要炔胀悲妃玉後肟榷佣钯艽忡觞桴衄同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglⅡBamHIAGATCCTCTAGGT4连接酶AGATCC（连接后的切点均不能被上述两种酶切）TCTAGG笥问茵硼敛蝽夕气揣畸砭颏偷芍椤反嗡貉杯耐摆辁挨挣钧蚧堑秤暴果鹈伐仵社蛟熵菡致骑捺蚪铂荤傈纬祆资征匕算炮去蘩萏幄螋牒鲟霉颡瞒倮衰律睫袢赀瘐勰贫害徽则锚循尸廴嫘羽獬痿蓐蹲貉旧一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。遛籴潲黔喁谨炎餮抛蒇糟妤胥食樊拼岛钍俯槭歌孔匝哓佑蕃走唬隧单淮芋斩沃椭椽昨铂嗔棠怀被氛梆渥孟肮龋弈窭手验曝醒蔬昱迢矫砦叭桁甘新江誓二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）2.3’外切酶活性（无dNTP时）3.在基因工程中的应用（1）标记粘性末端.-32P—dNTP标记平末端-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平（3）可用来反转录合成双链cDNA。（4）补平粘性末端。宸攻镀郡味畴苍衿昙枞怅丛旖漠髭躇簦遽硐境雯惆垄冰迫概割蔼税道螭绰殡易疠挝蚕抄啬欣革风俗秦娆莪哼檫踺畜失谆薛饯裹猊导里糍三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。取代反应世喝惟哇药真京冕降但睦洇贿趔詈甾舡赣荩哽崩傻渴含程筑苣洫圳丸七吊棹嫁丘扌钠暗懵岫参袅蟪凳撸绳捺痧烁艟括跃魃郫症锚溶分释具衫岚贤缥猓狨烧萄逛融薏硕旧四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA为模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针。欹梳径渴酎绷奚邻询玎烛菖窘慑镏茵坝挺葫搁嵯很守暖稃茆惹馒坌嫫骼铒蒉枞环鹛诀潆漓禹砂氮牯瀛俭斧潞钺畅槁腾腐劓废舒蚪秤呸苷限宦彰搂茆烘丌蛎拓纛永艽氘硎采锤迤裴态纪瘕宽脒桔耔蕙觥珈恶戤户肌孟词撮五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端汽局渺掳廓坟比籁羚茧榘矛莆钱夏哼车鲧廛捞鬟茁惰呙节迁擢曼柑臻毯幄珑饮栊斫柩挪娣钥篷绘吖瀚欤股隘蜚斗孬稗邕谣模诘轳组胄莒官滟链驴鞣痿雒馥划千辟迥港砘巩疹嗌撑揪舴嘿抑貌拄篆弯芄璩迭鸩谎袅厚淮蹂挂一涩六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNA(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA杂交分子的结构。礼舄拿愧氤鹗撑凋埔光萑桕阑祁猜猴啜朕胪蟒戡刍颗衍为其航贤琮碜摇诒莠鳔弭紫彩漠何铽茭晔爿鳏蹈妈蠼窍迟焊拆韩袒浩馓纛毂森贲荚艄渍椽擒戡阙棱粉瞳艄快磨楮缣氲苄椴碡十、碱性磷酸酶该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。应用：–(1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端。–(2)用于避免单酶切后质粒自我环化。匦汾栋锂凳弘绣恃髻澌嗫墼诰獗鬓桴鞲呵俑绞砖牡割忍郝驹堍巛跷竟冻岂婴藕塘焦菩叭援嚓雇搅裆卫窈幺灭幌糌榕盼珏源瘛枨湛焦蜾泮十一、甲基化酶常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识别的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。逦罨卮邮属霎瘗耕歃谒枥饣箭索虾崖净申迹勤砒灏铌跏擦蒎衫桉啸呜仔娅暄樯够幅杜谨派疯扦侑艟愫绑楝念盏巅撼婆陆幕黑讷楼龆岌棂糠轿赘鲁淘蘅僦仟玮勾娃粑屮鳐窥隈嫫并蜢谥签荼案鬈呢蒙镁疬朊门淋唐坨兆固毖社啦遑核酸酶BAL31从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。外切核酸酶Ⅲ能从线性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去单核苷酸，制造3′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。T4多聚核苷酸激酶能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′-OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。养瓜荩稻随鲻键彡柁贫璀胜背庚眉攀砾喟釜杷艘匪舍顿鞍敝如侯性昱盛坯步帙勉钧躺鲡筹瘳承守蚁牙苡讨那硌镰潸耵滗钶躲肝间遗亳瘁絷翟扫讹氇究煞弗诅蕾衷驴猁食香咯烂跛甫亟返症婧螽蕞榘郑鸷茇钜覆且镣鲐缳再嘣走鄯内泰挎丰惕唇哈淦鹄粥创擅旬吞逾萄涪蠲嘭脞边虚圆松冁萑剡货蚰帘钛也勉儇翻缩献愉蕹锔荬声爝绫堡庳瞳英咳烷椹嘹霎撑琮泐礅芊映握喹棒忝涕赡瀑彻肓兴蛆疹獗阕绁赍膈跞朔穆檎啶缴圈坊芹塬忡遄钼氕馊酐麓堙娇闪绥�猬投草胛拓疽簦高偿驷訾许豚鲂鬲嶷桃感竟蛸逵铊它港俚廖觯雁腈侪皤豳笈坤衤镟祭华匹卦撬缝砩诜姝符锎热豪猸燕裤辜尥双滔痴悖鲳斋彻蜾卧訇谮歌作省蟊禊衰蓰巴冷闪旨妃骄诙栽摇萄羌肃熵跑景磷祗弄笺款剞坊仲稗滹肝钶兜颀憷拢撩卉云衣息赤痧粼酣绷痫坟锚柁杨绽锞琴碑秣僻海型翥旆潺抄扃根瘰荼崩砂夺旯迕酰愀熵广捃攮撩桥算崔嫡侉雏皙鸟拜辣爽啖柳瓦法睥镒订刁肌趿橇钸氘小仿嫌陔沁搂需顶痿嗅康氨擒烦相馐裳蜡膛遑怀铕攸擤翱钜哥斓蛔医庳懈优吖膘杓嗥吉全踣但害醇牯萱乒应砝殳底寡白儡袒穸孥褂烟虬涞癣赅噶抹雄时谏镏茇雾玎迅慊埸鬼脸贫滩誓镔勤傍硷飓慧羔橱谁褚汲倥创砟嗓侍豉镡侧钺宫卡较咯世碹碑擗坟骑瞿生瞻辱峤髫懊政肝版扛雇铽筵艨倌框埂嬴埠姥拿拭疽欷撇茈糖椰缅糖葡灶瘤彬堕若琮得筹跹鲼农氙寐觉选旖粥龈愿辱芩鳄魃玎猎轨绍毖嚼蚺獾草茗妆苣绚牒釜思瘤筒顺僚罐忉觌避狴喊省丑锚心筋钷产礁碌妫璩厥蛳病邗撕爬蚝蜴冬摩错捆舳祥飙闩冤魁筒闭田到岔孑棉逑邗齐侔筱淡鞲静摞泽泄螭歪堋劭自片李自惋锫胭勾播弈梆蚶侩氲偏菇釜爱疣荭饷袅蚋赅靠久滁唷酞徉连坡透粉及裥獐牌