基因工程的载体

第三章基因工程的载体一、概述二、质粒载体三、表达载体一、概述•1概念•载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。•克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。•表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。一、概述•2功能•运送外源基因高效转入受体细胞；•为外源基因提供复制能力和整合能力；•为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。一、概述•3分类•按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体•按功能和用途分：克隆载体和表达载体•按性质分：融合型载体和非融合型载体•按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体一、概述•4特性•载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；•载体容易从宿主细胞中分离纯化；•有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；一、概述•4特性•能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；•载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；•载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；•用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子和终止子等；二、质粒载体1、质粒的基本特性2、常用的质粒载体3、质粒DNA的提取4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化二、质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。1、质粒的基本特性（1）概念①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；③大小为1kb-200kb，也有更大的。双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）构型：共价闭合环状、开环和线性（2）质粒的复制﹡复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。﹡复制子有不同的组成方式：滚环、θ等；﹡在E.coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子。（3）拷贝数严谨型：拷贝数较少，大约1-几个松弛型：拷贝数较多，几十至几百一些质粒载体所携带的复制子及拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115-20pUC载体pMB1500-700pACYC及其衍生质粒p15A10-12（4）质粒的不相溶性﹡两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相溶性。﹡在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相溶的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。（4）质粒的不相溶性﹡不相溶群：指那些具有不相溶的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。现已发现30多个不相溶群。（5）转移性﹡在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。﹡要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点。﹡例：pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白质作用下，通过接合性质粒来进行转移，但大多数载体无nic/bom位点（如pUC）。（6）选择标记选择标记基因用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来。(1)氨苄青霉素抗性基因ampicillin,Ampr,ampr青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。Ampr编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。（2）四环素抗性基因tetracycline,tetr四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。tetr基因编码一个由399个aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。（3）氯霉素抗性基因chloramphenicol,Cmr,CatCm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。Cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白，每个亚基23kDa。氯霉素乙酰转移酶在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合。（4）卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin/neomycin可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷。这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)-II)所灭活，该酶为25kDa，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞质内的主动转移。（5）SupF琥珀突变抑制基因终止密码：UAA（赭石），UAG（琥珀），UGA（乳白）SupF编码细菌的抑制性tRNA，在某一宿主中含具琥珀突变的tetr和ampr，只有当含SupF的质粒转入后，宿主才会对amp和tet具抗性。（6）其它正向选择标记质粒可编码一种使某些宿主菌致死的记忆产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。筛选标记插入失活：在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。筛选标记α-互补（α-complementation）LacZ´基因的互补编码缺失第11-41位氨基酸宿主LacZLacZΔM15β-半乳糖苷酶1024aa载体140aa140aa+MCSLacZ´IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Isopropyl-β-D-Thiogalactoside诱导物X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside底物（生色剂）β-半乳糖苷酶分解x-gal形成蓝色产物MCS：MultiplecloningsitesLacZΔM15LacZ´IPTG/x-galLacZΔM15LacZ´蓝色LacZΔM15LacZ´ΩDNAIPTG/x-gal白色在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和前140个aa的编码信息，在这个编码区中插入一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在β-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。lacZΔM15编码缺失第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶，但无酶学活性。当LacZ´与lacZΔM15的产物混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/（MCS），并在受体菌中引入lacZΔM15即可实现α-互补。在生色底物（x-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源基因插入到质粒的MCS后，几乎不可避免地导致产生α-互补能力的氨基酸片段。α-互补：LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。lacZΔM15放在F质粒上，随宿主传代lacZ´放在载体上，作为筛选标记相应的受体菌：TG1，XL1-Blue，JM101等。（7）质粒载体的多克隆位点基因工程载体含有一个人工合成的多种限制性内切核酸酶的单一识别序列，称为多克隆位点（multiplecloningsite,MCS)（8）质粒DNA的电泳特征共价闭环DNA：covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA开环的双链环状DNA：opencircularDNA，ocDNA线形DNA：linearDNAL-DNA共价闭环DNA开环的双链环状DNA线形DNA2、常用的质粒载体具备以下特点：①在宿主细胞内必须能进行自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选。（1）pSC101，ColE1载体较大，酶切位点少﹡转化效率与大小成反比，大于15kb转化效率成为限制因素；﹡质粒约大，约难于用限制酶切进行鉴定；﹡质粒约大，拷贝数越低。改进策略：﹡去掉多余片段﹡提供多克隆位点﹡筛选标记﹡增加辅助功能：表达载体（2）pBR3224361bpGenBankV01119,J01749含有30多个单一位点ampr和tetr可通过插入失活进行筛选（3）pUC18，pUC19﹡2686bp﹡GenBankL08752/X02514﹡来自pBR322﹡ampr﹡MSC有10个位点﹡α-互补﹡用途：cloningexpression(利用lacZpromoter)sequence(universalandreverseprime)pUC18（4）pUC118，pUC119﹡3162bp﹡GenBankU07649/U07650﹡ampr﹡MSC有10个位点﹡α-互补﹡用途：分离ssDNA，诱变，探针，测序pUC118pUC119（5）pBluescriptM13+、M13-又叫pBluescriptSK+、SK-﹡2960bp﹡GenBankX52325/X52326﹡ampr﹡在MCS位点两侧，含有一对T3和T7噬菌体的启动子﹡α-互补﹡用途：测序，探针pBluescriptSK+、SK-（6）pSP64、pSP65﹡2999/3005bp﹡ampr﹡含有噬菌体SP6的RNA聚合酶启动子﹡用途：克隆外源DNA片段探针pSP64pSP65（7）pGEM-3Z﹡2743bp﹡ampr﹡含有噬菌体的T7和SP6启动子﹡用途：克隆外源DNA片段探针pGEM-3Z（8）pUCm-T﹡商业化的克隆载体﹡用于PCR产物的克隆﹡2773bp﹡ampr3、质粒DNA的提取质粒DNA的小量制备（碱裂解法）（1）细菌的培养将3ml含相应抗生素的LB培养基加入到10ml的细菌管中，然后接入一单菌落，于37℃、150r/min下培养过夜。（2）细菌的收获将1.5ml细菌培养物加入1.5ml离心管中，于4℃、8000r/min离心30s，倒掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。（3）质粒的提取1）将细菌沉淀重悬于100l的溶液I中，剧烈震荡（可用振荡器）。溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）2）加200l新配制的溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS），盖紧管口，快速颠倒离心管数次，以混合内容物。直到溶液变粘稠、清亮，即开盖时有拉丝现象。3）加150l用冰预冷的溶液III。溶液III：5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上10min。4）于4℃、10000r/min离心10min，将上清液转移到另一离心管中。5）加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混合。于4℃、10000r/min离心5min，将上清液转移到另一离心管中。重复该步骤直至两相界面上看不到蛋白质层。6）加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合。于4℃、10000r/min离心5min，将上清液转移到另一离心管中。7）加入1/10体积乙酸钠（3.0mol/L，pH5.2），再加2倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀30min。8）于4℃、10000r/min离心10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使大部分液体流出。9）用70%乙醇于室温洗涤DNA沉淀。去掉上清液，在空气中使核酸沉淀干燥。10）用50l含无DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE（pH8.0）重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。质粒DNA的大量制备（碱裂解法）（1）细菌的培养将一单菌落接入含有相应抗生素的100mlLB培养基中，于37℃、150r/min培养至菌液混浊。（2）细菌的收获用50ml的离心管于4℃、8000r/min离心10min收集菌体，分两管收集。（3）质粒的提取1）加入3ml的溶液I，剧烈震荡。2）加6ml新配制的溶液II，盖