搜索
第一章植物组织培养实验室的构建与操作技术•主要内容组织培养实验仪器设备及使用方法培养基的制备方法和步骤外植体的灭菌方法无菌操作技术褐变和玻璃化原因及应对措施实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。•实验室的大小应取决于工作的目的和规模•按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱•利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件第一节植物组织培养实验室及主要设备一、实验室设计与设备组培的常见技术路线：外植体→愈伤组织→不定芽→生根→再生植株基本的工艺流程：容器具洗涤，物质准备→配置培养基并灭菌→外植体消毒与无菌操作接种→观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）→再生植株标准的组培实验室洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室等基本组培实验室准备室（含配药室）、缓冲间、无菌操作室、培养室•功能：进行一切与实验有关的准备工作•器皿洗涤、药品的配制•培养基配制与分装•培养基和培养器皿的灭菌•培养材料的预处理等•要求：•明亮、通风•便于多人同时工作•地面应便于清洁，并应进行防滑处理1、准备室（化学实验室）准备室主要仪器设备：(1)工作台(2)药品柜(3)冰箱普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。(4)天平感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为0.1g的托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）放置在水平、干燥、不受震动的操作台上(5)恒温水浴锅(6)蒸馏水发生器蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水）(7)电炉(8)高压灭菌锅进行培养基、水和器械用具的灭菌不锈钢蒸馏水器（单蒸水）(9)酸度计测定培养基及酶制剂的pH值（普通实验可使用pH试纸）(10)烘箱干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重(11)摇床振荡培养(12)离心机分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计全温型恒温培养摇床多振幅高速轨道摇床２、缓冲室（注意门的朝向）•工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩•功能减少人体从外界带入的尘埃等污染物。•要求缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。３、无菌操作室（接种室）•功能外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备等•要求环境干爽，清洁，居于上风位空间宜小不宜大地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角室内物品越少越好，尽可能减少空气流动•维护方法定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）及时维护（干燥、洁净）接种室主要设备及用具•接种箱主体为玻璃箱罩、入口有袖罩•超净工作台操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留•解剖镜分离微茎尖、转基因等•无菌操作用的器具酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等４、培养室•功能接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。•要求：•能控制光照和温度•保持相对的无菌环境•有排风窗和换气扇等培养室的换气装置•有适宜的培养架，日光灯照明。•主要设备•培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。小型臭氧发生器二、培养器皿及用具1、培养器皿（包括玻璃器皿和塑料器皿）各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。2、微孔过滤器（细菌过滤器）0.45微米，抽滤灭菌用，如激素3、器械用具镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。第二节培养基及其配制定义：培养基(culturemedium)——根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。是植物组织培养的重要基质。•不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同•没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官•找到一合适的培养基，是培养成功的基础。一．培养基成分主要为：水无机盐有机化合物生长调节物质培养体的支持材料１．水水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。培养基大部分是水（固体培养基约75—80%）天然水或自来水不能直接用于培养基配制原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水。大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。•保持母液及培养基成分的精确性•防止贮藏过程发霉变质２．无机盐类(inorganicelement）离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为：大量元素微量元素大量元素指植物所需元素的浓度大于0.5mmol／L的元素，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收N有硝态氮KNO3和铵态氮(NH4)2SO4两种形式（一般NH4—N对植物生长较为有利）。微量元素•浓度小于0.5mmol／L的元素，有Fe、Cu、Zn等。•铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。3.有机化合物(organiccompound)[基本培养基（只含有大量和微量元素）]为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等（１）糖类（碳水化合物）碳源，维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖。不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖（２）维生素明显的促进离体培养物的生长。盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸、生物素、抗坏血酸-Vc等。一般用量为0.1～1.0mg／L。（３）肌醇（环己六醇）促进胚状体和芽的形成。用量一般50-100mg/L。（4）氨基酸常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）用量在10-1000mg／L之间。（营养丰富，极易引起污染，如在培养中无特别需要，以不用为宜。）（５）天然复合物（包括部分蛋白质水解物）其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。成分大多不清楚，一般尽量避免使用。椰乳使用最多、效果最大。用量为10%—20%（愈伤、细胞培养）。香蕉汁用量为150-200ml／L，缓冲pH值（兰花组培）。马铃薯用量为150—200g／L，缓冲pH值。其他酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。４、生长调节物质（植物激素）植物激素（hormone）是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等多种生理生化活动，是培养基的关键物质。主要包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素生长素0.05-5mg／L细胞分裂素0.05—10mg／L。（１）生长素类(auxin)生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞脱分化，诱导根的分化和促进细胞伸长生长。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质常用IAA、IBA、NAA、2,4-D配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中•IAA--天然生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，受光也易分解•NAA--启动能力比IAA高出3-4倍，可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，应用较普遍•IBA--促进发根能力较强※NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。•2，4—D--启动能力比IAA高10倍，特别是促进愈伤组织的形成，同时强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应腺嘌吟的衍生物，包括6-BA、Kt、Zt等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。作用：•诱导芽的分化•促进侧芽萌发生长•促进细胞分裂与扩大（茎增粗），抑制根的分化，延缓衰老多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。（２）细胞分裂素类(cytokinin，CTK)（３）赤霉素（gibberellicacid）有20多种，培养基中添加的是GA3，一般极少使用作用促进幼苗茎的伸长生长促进胚发育成小植株；离体培养下，还与生长素协调作用对形成层分化有影响当生长素／赤霉素比值高，木质部分化，比值低，韧皮部分化。打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。在器官形成后，添加赤霉素有时可促进器官或胚状体的生长激素配比模式生长素/细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。生长素/细胞分裂素高利于根、愈伤组织的形成适中利于根芽的分化低有利于芽的形成生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用。同时其在培养基中的绝对值也会影响外植体分化发育的方向。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNo6-BA6-BAreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.５．其它附加成分（１）琼脂(agar)是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量6-10g／L，不是培养基必需成分。（２）活