Western-blot_试验技术

Western-blot试验技术概论•它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。•具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。•被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。溶解蛋白策略•1使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。•2采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。•机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。•往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。•为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。溶解方法•溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质：•1表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。•2酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。•3哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。•4哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。细胞准备•用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。•超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。•4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。•有必要时重复上一步骤。•上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf-80°C保存注意事项•细胞裂解液的量•超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。•检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。•只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。•未知蛋白应同时作阳性对照。主要试剂•RIPA（华舜公司）•苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司）•丙烯酰胺（Amresco公司）•双丙烯酰胺（Amresco公司）•丽春红染料（华舜公司）•Tween20（Amresco公司）•过硫酸铵（Sigma公司）•四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司）•硝酸纤维素膜（Amersham公司）•考马斯亮兰（Fluka公司）•兔抗大鼠Glut1多克隆抗体（SantaCruz公司）•Phototope-HRPWesternBlotDetectionSystem（CellSignalingTechnology公司）仪器与设备•低温超速离心机（Eppendorf公司）•分光光度计（Eppendorf公司）•Thermomixer（Eppendorf公司）•电泳仪（Bio-Rad公司）•垂直式电泳槽（Bio-Rad公司）•硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad公司）配制试剂•10×电泳Buffer称取Tris-base30.3克glycine144克加去离子水，定容至1000mlSDS10克•1.5MTris.HClPH8.8称取18.15克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml•0.5MTris.HClPH6.8称取6.0克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml•转膜缓冲液称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前加200ml甲醇10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。配制试剂•30％Acry-Bis29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O100ml配成，避光4℃保存•10％过硫酸胺，新鲜配制，1week0.1克过硫酸胺加ddH2O1ml配成，4℃保存•封闭试剂10×TBS（应用液：1×TBS）10×TBS：取24.2克Tris－Base80克氯化钠用800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至1000ml1×TBS：取10×TBS50ml，稀释至500ml，临用前加0.1％Tween20，500ul。配制试剂•4×SDSSampleBuffer2.4克TrisHCL，溶解在30ml水中，调pH6.88克SDS0.4克溴酚兰定容至100ml40ml甘油10mlDTT贮存液•1mol/LDTT贮存液：0.01mol/L乙酸钠20ml3.09克DTT过滤除菌后-20℃保存，分装成1ml。•考马斯亮兰染液：45ml甲醇45ml水用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质10ml冰乙酸0.25克考马斯亮兰R250抗体选择•一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。•多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。•设置对照：1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体）2样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品•选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物为佳。实验步骤•配胶•制胶先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。•上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。•100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳结束。实验步骤•转膜小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带，再用TBST漂洗至膜发白。•封闭称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml，使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封闭液中，室温摇2h后。实验步骤•一抗杂交孵育将一抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。二抗孵育•二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。实验步骤•显影：将膜置入10mlLumiGLO溶液中（10mlLumiGLO溶液配方为：0.5ml20×LumiGLO、0.5ml20×Peroxide、9.0mlMilli-Qwater），室温轻摇1分钟，注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液中洗2-5min；水冲洗，可在相应位置见到目的条带。疑难杂证•没有注明可以用来做westernblot的一抗，可以用来做westernblot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于westernblotting，因为在westernblotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。疑难杂证•做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。疑难杂证•westernblot使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献疑难杂证•做western，在分子量很低的位置总是出现一条很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？是蛋白降解了吗？有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也是可能的，关键是你要的位置出现了吗？减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视具体情况了。疑难杂证•请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd66kd、45kd、30kd、21kd、14kd！跑蛋白时，分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd，蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可以分开切胶！疑难杂证•分别用多大电流转膜?一、一般跟你的分离胶的浓度有关。二、与你的转印系统型号有关.三、与目的蛋白的分子量有关.一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；疑难杂证•WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请指教.做WESTERN必须要内参吗？1、一抗、或二抗抗体浓度太高2、多克隆抗体本身的非特异性反应3、抗体的特异性不强4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。疑难杂证•western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。疑难杂证•以下是关于合适抗体选择的优缺点比较，帖子上表格排不齐，只好以图片形式抓了下来。疑难杂证•为什么细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多，1细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；3抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。•细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：1有沉淀可能是因为蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长，2也不排除抗原浓度过高，这时再加入适量samplebuffer即可。疑难杂证•蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间.也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤可•目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时