湿热灭菌工艺的微生物学验证方案

湿热灭菌工艺的微生物学验证2012年9月2药害事件与GMP的发展•cGMP的诞生与发展•药害事件中的产品特点成分复杂对质量要求高劣质产品具有致命性患者在使用前无法确定药品的质量3案例分析（续）•1972年，英国，德旺波特事故–英国德旺波特医院输液灭菌过程不力而导致污染，造成至少5例败血症患者死亡的事故。»消毒柜的排气阀已被碎玻璃和纸团堵塞，导致在灭菌时，消毒柜内的空气无法顺利排出，局部空间达不到预定灭菌温度»温度记录仪损坏»在取样和检测方法上存在失误»未按照书面规程操作灭菌釜»设备维修保养存在缺陷4其它案例1907鼠疫疫苗破伤风梭菌1943荧光素滴眼液铜绿假单胞菌1946免疫血清疫苗金色葡萄球菌1948滑石粉破伤风梭菌1966抗生素眼药膏铜绿假单胞菌1970洗必泰消毒剂洋葱假单胞菌1972静脉注射剂假单细菌、欧文菌、肠杆菌属亚种1977隐形眼镜护理水黏质沙雷菌、肠道细菌属亚种1981外科敷药梭菌属亚种5注射剂的特点药效迅速，作用可靠可用于不宜口服给药的患者，发挥局部定位作用注射给药不方便，注射时有疼痛制造过程复杂，生产成本高直接入血制剂，质量要求比其它剂型更严格，使用不当更易发生危险6注射剂的质量要求无菌，成品中不得含有活的微生物无热原澄明度，不得有肉眼可见的浑浊或异物安全性，不得引起对组织的刺激性或发生毒性反应渗透压、pH、必要的物理和化学稳定性7无菌药品生产管理要点防止微生物污染防止热原或细菌内毒素的污染防止产品中有异物装量准确8无菌药品的两种生产方式最终灭菌工艺在高洁净环境下进行灌装和密封通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌封在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险9两种生产方式的比较无菌生产工艺的局限通常的无菌保证水平(10-3至10-6)影响因素多最终灭菌工艺的优点赋予产品更高的无菌保证水平生产中可变因素少，出现偏差的概率低几乎能杀灭产品中的所有微生物10欧盟要求(CPMP/QWP/054/9800)包材热稳定差不得成为采用无菌工艺的唯一理由。企业应当将选择适用于某个处方的最佳灭菌方法放在首位，然后再考虑相应的包装材料。产品包材的选择可能必须考虑许多其它因素…。此情况下，应…在注册申请资料中作出科学合理的解释。…，如容器类型、给药途径…（如某些眼科用药），而该容器无法经受最终热力灭菌，…一般是可以接受的。…此条件下，企业有责任继续寻找可接受的替代容器，以便尽早采用首选的最终灭菌法。由于最终灭菌具有最高的无菌保证水平，因此，不得因商业原因取消最终灭菌法。11最终灭菌产品无菌保证的主要环节产品的无菌保证灭菌前微生物污染包装密封性灭菌工艺灭菌设备灭菌工艺验证二次污染原料设备和生产过程生产环境生产时限12无菌工艺产品无菌保证的主要环节产品的无菌保证非无菌生产过程（控制微生物污染）包装密封性设备材料药液的灭菌原料设备和生产过程生产环境生产时限工艺设计＋人员防护操作模式环境监测与评价无菌生产工艺验证质量标准、微生物学检验方法及验证、设备与工艺验证、环境监测、工艺与过程控制、更衣、人员培训无菌生产过程(防止微生物污染)13灭菌工艺在无菌药品生产中的应用•最终灭菌产品灌装在容器中的药品必要时，产品溶液或粉末、内包装材料、设备、管路必要时，用具、人员防护装备等•无菌工艺产品产品的组分、内包装材料和直接接触设备A级（或ISO5级）内，任何接近产品的材料、人员防护装备、用具等14灭菌的主要目的•杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽胞•最大限度地提高药物制剂的安全性•保护制剂的稳定性•保证制剂的临床疗效研究、选择有效的灭菌方法，对保证产品质量具有重要意义15经典灭菌方法在制药业中的应用最终灭菌药品–湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法无菌工艺药品–除菌过滤法（如产品、工艺气体等）–湿热灭菌法、干热灭菌法–辐照灭菌法（如防护装备、滤器、一次性用具等）–液体灭菌法（如某些生物制品、器械）–气体灭菌法（如防护装备、滤器等）–低温蒸汽灭菌法（进入隔离器的包装材料等）16灭菌工艺的设计原则产品特定性灭菌工艺过度杀灭法灭菌工艺验证时和日常灭菌前微生物监控所需要的信息量预计效期供热量上升上升下降17灭菌工艺的设计原则Bioburden-basedprocess含菌量控制工艺StabilityStabilityStabilitySterilitySterilitySterilityOverkillprocess过度杀灭工艺相同温度下时间递增灭菌前含菌量和耐热性监控信息需求递增（USP）Biologicalindicator/bioburdencombinedprocess生物指示剂/含菌量联合控制工艺18湿热灭菌又称为Moistheatsterilizationunderpressure–细胞内起关键作用的蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用。只要可能，通常取121℃（2个大气压）–优点：无残留，不污染环境，不破坏产品表面，容易控制和重现性好–包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器、过热水灭菌器等19湿热灭菌国外法规和指南–USP–ISO17665–ISO11138-BI,–ISO11140-CI–HTM2010–EN554,285–PDATechnicalReportNo.1脉动真空灭菌器示意图20干热灭菌原理：使微生物氧化而不是蛋白质变性，因此温度要高得多，时间也相应延长利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的特点，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热灭菌适用于耐高温但不适于湿热或可被湿热破坏的物品，如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类，耐高温的粉末化学药品等干热灭菌不适用于橡胶、塑料及大部分药品。21干热灭菌国外法规和指南–USP–ISO11138-BI,–ISO11140-CI–ISO20857–PDATechnicalReportNo.3–PDATechnicalReportNo.722气体灭菌灭菌剂的种类–环氧乙烷（ETO，C2H4O）–臭氧（Ozone，O3）–二氧化氯（ChlorineDioxide-ClO2）气体灭菌不同于低温蒸汽灭菌23辐射灭菌辐射类型–α射线，穿透力差–β射线，穿透力略强于α射线–γ射线，穿透力很强–X射线，人工产生的电磁辐射–电子束，可用于表面消毒（低能量）或内部消毒（高能量）电离辐射杀灭微生物的作用，可以分为直接作用和间接作用两种辐射灭菌国外法规和指南–ISO11737–PDATechnicalReportNo.11–PDATechnicalReportNo.1625过滤除菌定义：•除菌过滤是指除去流体中微生物的工艺过程，该过程不应对产品质量产生不良影响。•包括液体和气体除菌过滤。药品生产中采用的除菌过滤膜的孔径一般不超过0.22um（或者0.2um，这两种标称没有区别）除菌级过滤器可以有不同的大小、形式和膜材，过滤器的使用者应当根据使用需要选择不同的过滤器。26过滤除菌除菌级过滤器是指在工艺条件下每cm2有效过滤面积可以截留107CFU的缺陷假单胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146）的过滤器。影响细菌截留效果的因素–过滤器源的因素，如过滤器类型、结构、基础聚合物、表面改性化学、孔径分布和过滤膜的厚度等–工艺源的因素，如流体组分、流体性质、工艺条件，产品、料液和生产环境中实际微生物污染的特点和水平等27过滤除菌国外指南性文件–PDATechnicalReportNo.15–PDATechnicalReportNo.26–PDATechnicalReportNo.40–PDATechnicalReportNo.4128低温蒸汽灭菌气体灭菌与低温蒸汽灭菌的区别•气体灭菌穿透性好，分布均匀，不易受到温湿度影响•低温蒸汽灭菌，两个阶段的浓度不同，条件不易控制来自PDASterilizationTechnology29低温蒸汽灭菌灭菌剂的种类–过氧化氢（HydrogenPeroxide，H2O2）–过氧乙酸（PeraceticAcid-C2H4O3）–甲醛（Formaldehyde-CH2O）低温蒸汽灭菌的特点–室温残留，穿透性低，环境中的温湿度会有差异，工艺的均一性不好30基本概念•无菌(Sterility)：是指产品中不存在任何活的微生物。这个绝对的概念，无法用实验来证明，不能成为工业标准•灭菌工艺(Sterilization)：–通过适当的物理或化学手段，将一定数量的活性微生物完全杀灭，并且使其生命活动产生了不可逆转的过程。最终灭菌是最常采用的工艺，新版GMP附录已明确，不包括流通蒸汽灭菌•无菌保证值（SAL）：指经灭菌后非无菌品的概率。通常为10-6或10-3（来自ISO11139）31湿热灭菌的能量转移湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌，尽管有时也采用过热水灭菌，如水浴式或喷淋式。蒸汽灭菌是一个高效的热传递方式，因为蒸汽接触温度较低的物体时，会释放潜热，生成冷凝水，直到物体温度与蒸汽温度相等。32湿热灭菌的热力学基础水140120100806040200-20508Joules2707Joules水和蒸汽饱和蒸汽2199以恒定速率加热在2个大气压下的水加热曲线温度℃160过热蒸汽33湿热灭菌工艺的无菌标准原则标准--定义通过物理/生物学方法证明，单位产品内微生物存在的概率不得超过百万分之一，即批产品的污染概率不得超过百万分之一实际控制标准过度杀灭法（F0≥12）残存概率法（F0≥8）Fo≥8最早在出现在USPXIXP709、BP1980A196中。不应当将Fo≥8简单地等同于无菌标准34USP-过度杀灭标准示意USP过度杀灭法每瓶100万个芽孢，其D=1杀灭到100后，再使其存活概率下降6个对数单位标准灭菌时间Fo达12以上药典无菌标准生物负荷及其D值均可能不同，在将其杀灭到100后，法规要求再使其存活概率下降6个对数单位—可理解为安全系数。SALlgN6543210-1-2-3-4-5-602468101235湿热灭菌中的微生物死亡模式实验表明，在恒定的灭菌温度下，同一种微生物的死亡遵循一级动力学规则，其死亡速率是微生物的耐热参数D和杀灭时间的函数，与灭菌程序中微生物的数量无关。可用下面的半对数一级动力模式表示：LgNF=LgN0-F(T,z)/DT[等式1]NF灭菌F分钟后，微生物存活的数量F(T,z)灭菌程序在T℃和温度系数z下的等效灭菌时间DT微生物在T℃下，下降一对数单位所需的时间。说明：该特定温度必须与F值计算中所采用的温度相一致N0初始微生物的数量36无菌检查实验的局限性•实验本身存在统计学局限性p,批产品的污染率；n，取样量批检验不合格的可能性=1-(1-p)n取样量实际污染率0.1151015100.010.090.400.660.80200.020.180.650.890.96500.050.340.920.991000.090.630.993000.260.953,0000.9537湿热灭菌工艺决策树是热不稳定材料吗？按产品特性设计法采用过度杀灭设计法被灭菌品的形式？需考虑抽真空？现抽真空灭菌器？脉动真空程序重力置换程序否是多孔固体物品密封液体产品要过热水或SAMSAM程序任何湿热程序有无可不可可用过热水程序？要不要需加压吗？SAM：表示蒸汽及空气的混合物不要38药典要求EP对过度杀灭法的工艺要求：对溶液的灭菌条件至少为121oC×15分钟；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上述相等效。目标：SAL=10-6或更低39药典要求EP对过度杀灭法的工艺要求：对溶液的灭菌条件至少为121oC×15分钟；也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上述相等效。目标：