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第二章紫外-可见分光光度法2.1概述2.2紫外-可见分光光度法基本原理2.3紫外-可见分光光度计2.5目视比色法2.6紫外分光光度法2.4可见分光光度计2.7实验分光光度法分类:按所有光的光谱区域不同又可分为：1、可见分光光度法（400-780nm）；2、紫外分光光度法（200-400nm）；3、红外分光光度法（3×103-3×104nm）；其中紫外分光光度法和可见分光光度法合成为紫外可见分光光度法1概述紫外-可见分光光度法(UV-Vis)是基于物质分子对200-780nm区域内光辐射的吸收而建立起来的分析方法。由于200-780nm光辐射的能缺主要与物质中原子的价电子的能级跃迁相适应，可以导致这些电子的跃迁，所以紫外可见分光光度法又称电子光谱法。紫外-可见分光光度法的特点仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;选择性好;灵敏度高：误差较小：精密度和准确度较高;测试溶液的浓度下限可达到10-5-10-6mol·L-1；相对误差为2%~5%，某些精密分光光度计可达1%~2%;用途广泛，能检测多种物质等。1概述光的基本特性：1、光的波粒二象性：由上式可知，不同波长的光能量不同，波长愈长，能量愈小E为能量，eV(电子伏特);h为普朗克常数(6.626×10-34J·s);υ为频率，Hz(赫兹);c为光速；λ为波长，nn(纳米)。2基本原理物质的颜色与光有密切关系，例如蓝色硫酸铜溶液放在钠光灯(黄光)下就呈黑色；如果将它放在暗处，则什么颜色也看不到了。可见，物质的颜色不仅与物质本质有关，也与有无光照和光的组成有关。chhE物质对光的选择性吸收我们人眼看到的多彩世界是由于不同的物质能吸收不同颜色的光，不能被吸收的光则被反射后被人眼睛所感知的；由于物质对光的吸收是选择性的，利用不同检测物质对某波长的光的吸收特性来了解物质浓度等特性，这就是光谱法的基础；通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图2-1；在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。KMnO4溶液的光吸收曲线1-c(KMnO4)=1.56×10-4mol·L-12-c(KMnO4)=3.12×10-4mol·L-13-c(KMnO4)=4.68×10-4mol·L-12-1KMnO4溶液的光吸收曲线①高锰酸钾溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的，对波长为525nm的绿光吸收最多，在吸收曲线上有一高峰(称为吸收峰)。光吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长(常以λmax表示)。在进行光度测定时，通常取在λmax的波长处来测量，因为这时可得到最大的灵敏度。②不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样。所不同的是吸收峰峰高随浓度的增加而增高。③不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可利用吸收曲线来作为物质定性分析的依据。朗伯—比尔定律：A＝kbc朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即:A=Kbc式中:A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；入射光I0透射光It必须使用单色光吸收发生在均匀的介质吸收过程中，吸收物质互相不发生作用xt朗伯—比尔定律应用的条件影响吸收定律的主要因素：入射光非单色性引起偏离吸收定律成立的前提是入射光是单色光。但实际上，一般单色器所提供的人射光并非是纯单色光，而是由波长范围较窄的光带组成的复合光；溶液的化学因素引起偏离实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大；定律本身的局限性只适用于浓度小于0.01mol·L-1的稀溶液；吸收系数2-2偏离吸收定律2-3入射光的非单色性对吸收定律的影响3紫外可见分光光度计日本岛津UV-2450UV-1801紫外可见分光光度计UV-7504C紫外可见分光光度计紫外-可见分光光度计的基本构造基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显示器五大部分组成。光源单色器样品池检测器显示器紫外-可见分光光度计的基本构造1.光源在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。一般分为可见光源和紫外光源：可见光源：钨丝灯：波长范围为325～2500nm，最适宜范围为380～1000nm；卤钨灯：在钨丝中加入少数卤化物寿命更长更高效；紫外光源：氢灯或氘灯，发射的连续波长范围是180-360nm；紫外-可见分光光度计的基本构造紫外-可见分光光度计的基本构造2.单色器单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。棱镜:玻璃350～3200nm，石英185～4000nm。光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。543211.入射狭缝2.准直透镜3.棱镜4.聚焦棱镜5.出射狭缝紫外-可见分光光度计的基本构造3.吸收池用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用石英吸收池。规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm等。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要）吸收池要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。操作注意事项：手执两侧的毛面，盛放液体高度约为吸收池的四分之三。紫外-可见分光光度计的基本构造4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管、光电摄像管等。要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。5.显示器将监测器输出的信号放大并显示出来的装置。常用的液晶数字指示窗口和计算控制显示。•可见分光光度计（400-780nm）•紫外可见分光光度计(200-1000nm紫外可见分光光度计类型及特点波长范围•单光束分光光度计•双光束分光光度计•双波长分光光度计光路紫外可见分光光度计分类紫外可见分光光度计类型及特点（１）单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。紫外可见分光光度计类型及特点（１）双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。1-进口狭缝；2-切光器；3-参比池；4-检测器；5-记录仪；6-试样池；7-出口狭缝紫外可见分光光度计类型及特点（3）双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。无需参比池。△A就是扣除了背景吸收的吸光度。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。双波长BECKMAN-DU_640UV-1081紫外-可见分光光度计的使用仪器主要组成部件：UV-1801紫外可见分光光度计〔外形见图2-4)由光晾、单色器、样品室、检测系统、电机控制、液晶显示、键盘输人、电源、RS232接口、打印接口等部分组成，其光学系统如图2-5所示。UV-1801紫外可见分光光度计软件操作1、开机自检a,检查各电缆是否连接正确、可靠，电源是否符合要求，全系统是否可靠接地等；b,打开仪器主机；c,连接主机与计算机；d,仪器自检；UV-1081紫外-可见分光光度计的使用图2-4UV-1801紫外可见分光光度计外形图图2-5UV-1801紫外可见分光光度组成框图UV-1081紫外-可见分光光度计的使用UV-1801紫外可见分光光度计光学系统图UV-1081紫外-可见分光光度计的使用2、扫描被测溶液的吸收光谱a,单击工具栏菜单上的，便进入光谱扫描测量方式，如图下所示。所有图谱标签页用来显示所有图谱，其他测量图谱均用新增标签页来显示；UV-1081紫外-可见分光光度计的使用b，进行参数设置单击工具栏菜单上的进行参数设置，如图下所示;设置参数：点击光谱扫描参数设置页上的“常规”按钮，对测量方式、波长范围(注意：设置波长最小值不得小于170nm,波长最大不得大于1100nn0、光度范围、取样间隔（一般设为lnm）、扫描速度（一般设为中速）、参比测量次数、扫描方式、保存方式、文件名称、样品名称等等。UV-1081紫外-可见分光光度计的使用c,样品的检测1、单击工具栏菜单上的，开始进行测量，提示请将参比拉入光路，将参比液放入样品池内，根据提示，拉入光路，点击“确定”按钮。2、参比测量完成，提示将样品拉入光路，根据提示，将参比液取出，放入样品液，点击“确定”按钮，开始测量样品光谱。3、测量完成，提示扫描完成，点击“OK”，如左图所示，此时界面出现测量结果和相应的图谱UV-1081紫外-可见分光光度计的使用d，检测光谱峰谷波长选择要进行峰谷检测的图谱，单击工具栏菜单上的按钮，弹出峰谷检测精度设置窗口，如图4-1-16下图所示，输入检测精度（峰谷差值满足条件），设置完毕，按确定按钮。系统将峰谷值标注在测量图谱上，并且用列表的形式（峰谷检测数据）将峰谷值显示出来，并且峰谷检测精度将在表格数据的上方显示，如图划红圈处；如图右图所示；UV-1081紫外-可见分光光度计的使用e,数据保存和导入单击工具栏菜单上的,下拉选择保存项保存图谱；导入则导入数据，打开图谱，并且用多标签页显示；导出则导出测量数据到Excel。f.退出光谱扫描测量完毕一个样品后开启一个新的测量不需要退出测量界面。UV-1081紫外-可见分光光度计的使用3、光度测量a,单击工具栏菜单上的，进入光度测量方式，如下图所示。UV-1081紫外-可见分光光度计的使用b，光度测量参数设置及侧量单击工具栏菜单上的，进行参数设置，如图下图所示。在对话框中可对测量方式、波长、参比测量等参数进行测量；点击“公式”可以输入计算公式等。设置完后点击“确定”进行检测。UV-1081紫外-可见分光光度计的使用4、定量分析a,单击工具栏菜单上的，进入定量分析方式，如下图；b,比色皿校正:在进行定量分析前，应先完成比色皿校正。UV-1081紫外-可见分光光度计的使用c,设置定量分析参数单击工具栏菜单上的，进行参数设置，如图下图所示.可对波长测量方法（包括单波长法，双波长系数倍率法，双波长等吸收点法，三波长法）、测量波长、参比测量方式、计算公式、测量方法、曲线拟合等进行设置；UV-1081紫外-可见分光光度计的使用c,建立标准曲线（针对浓度法）点击标样栏上方“标样”进人标样测量单击工具栏菜单上的，开始进行测量，提示请将参比拉入光路，将参比液放入样品池内，如下图所示，根据提示，拉入参比，点击确定按钮。UV-7504C紫外-可见分光光度计的使用具体操作步骤见教材72-73页仪器维护及操作注意事项一、仪器的维护1.温度和湿度室温保持在15～35℃，相对湿度宜控制在45%～80%。防尘、防震、防电磁干扰，仪器周围不应有强磁场。不要暴露在阳光直射的地方，不要放在有腐蚀性气体或在UV波长范围内有吸收的有机和无机气体的环境内。2.如