荧光定量PCR原理--扩增曲线

荧光定量PCR技术专题内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过域值Threshold荧光定量PCR原理－－荧光域值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认Notemplatecontrol确认PCR扩增效率（E）:0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（r2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高不能进行多重定量缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立3’淬灭基团淬灭基团性质建议使用的5’报告基团TAMRA荧光物质FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非荧光物质FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探针法——荧光标记物的选择高度特异性重复性好可进行多重定量优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点不同定量方法的比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带不能进行多重定量适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好多重定量价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断内容概要荧光定量PCR原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量质粒标准品的制备PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1=2.03－1＝1.03标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988152025305×1035×1045×1055×106CopiesCt绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36=229087copies绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTPPPO双标准曲线法2-△△Ct法相对定量分析——两种常用的分析方法通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析——双标准曲线法检测样品管家基因H目的基因X定量结果定量结果校正值相对量对照样品6391.5343.40.05371.000待测样品18589.717.30.00200.037待测样品27432.91946.10.26184.874实验数据公式：F=2－相对定量分析——2法优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值－－－－△△Ct实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%△Ct（处理前）＝18－17＝1△Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct相对定量分析——2-△△Ct法内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量相关产品SYBR法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的RNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液