11-第七章-环境内分泌干扰物资料

第七章环境内分泌干扰物毒理学主讲教师：刘薇大连理工大学环境学院生态毒理学(Ecotoxicology)内容2一、环境内分泌干扰物的分类二、环境内分泌干扰物的危害三、环境内分泌干扰物的作用机制四、环境内分泌干扰物的筛检方法一、环境内分泌干扰物的分类（一）内分泌干扰物名称由来1997年《掠夺未来》,提出了内分泌干扰(endocrinedisrupting，ED)物质的概念。31996年“OurStolenFuture”提出。环境中存在着一类化学物质，当进入动物体内之后能起到干扰体内正常激素分泌的作用，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生，这类化学物质即所谓的“外源性内分泌干扰物质”内分泌干扰物质是指可通过干扰生物或人为保持自身平衡和调节发育过程而在体内产生的天然激素的合成、分泌、运输、结合、反应和代谢等，从而对生物或人体的生殖、神经和免疫系统等的功能产生影响的外源性化学物质。——美国EPA的定义内分泌调节物：引起完好无损生物体或其后代中内分泌功能变化不利影响的外源物质，它们主要是通过人类的生产和生活排放到环境中的污染物，又可以称之为环境激素。——欧盟定义（二）内分泌干扰物的定义4(三)环境内分泌干扰物的分类5EDCs天然化学物人工合成化学物天然雌激素植物雌激素真菌雌激素人工合成的雌激素环境化学污染物雌二醇、雌酮、雌三醇大豆异黄酮香豆雌酚玉米赤霉烯酮己烯雌酚、己烷雌酚炔雌醇、炔雌醚等二噁英、多氯联苯双酚A、邻苯二甲酸酯类等6按照EDCs的干扰功能分类EDCs③雄激素干扰物②甲状腺干扰物⑤胰岛素干扰物④糖皮质激素干扰物⑥肾上腺皮质激素干扰物……按照对EDCs的认识程度分类二、环境内分泌干扰物的危害危害致癌致畸生殖异常动物雌性化现象神经毒性其他如阻止植物固氮免疫毒性1.男婴出生率下降自20世纪70年代以来，加拿大男婴的出生率下降了0.22%，美国下降了0.1%。2.男性精子异常且不育患者增加，男子女性化程度加剧从1940年到1990年这50年间，人类的精子密度下降了50%3.诱发女性生殖系统问题性早熟、月经失调、子宫内膜炎症、不孕症、卵巢癌、乳腺癌等增加现在全球每年约有50万名妇女死于乳腺癌，且发病率以每年5％～20％的速度上升；20世纪60年代，美国女性一生中乳腺癌的发生几率仅为1/20，而20世纪90年代上升为1/8(一)对人体健康的影响4.对发育的影响胎儿和婴儿出现先天性畸形、发育不全和痴呆的病例增加。5.引起人的神经系统功能障碍、智力低下。6.可损害人体免疫系统，降低免疫力。7.诱发肿瘤发生(一)对人体健康的影响日本米糠油事件中PCBs（多氯联苯）受害者的惨状（二）对野生生物的危害上世纪50年代：英国水獭种群数量下降；1952年：佛罗里达鹰的数量下降；上世纪60年代：蜜歇根湖貂类丧失生殖能力，出生率下降；1970年：安大略湖80%鸥鸟死亡；1980年：佛罗里达鳄鱼发育异常；1988年：北欧大批海豹死亡；上世纪90年代早期：地中海大批海豚死亡1998年发现多只北极熊生殖器官变异；1994年4月，日本7条河流中的雄鲤鱼有1/4雌性化；MissingbackleftlegExtrabackrightlegTailnotabsorbed1996年夏天在明尼苏达州发现的畸形青蛙（二）对野生生物的危害三、环境内分泌干扰物的作用机制•EDCs能干扰体内內源激素的合成、分泌、运输、结合、代谢，影响内分泌系统的正常生理功能，而内分泌系统紊乱又使免疫系统和中枢神经系统受到伤害。（一）影响机体正常内分泌功能的机制1.与受体直接结合（1）与雄激素受体结合，表现出抗雄激素效应烯菌酮、杀虫剂［N-（3、5-二氯苯基）-1、2-二甲基环丙烷-1、2-二甲酰亚胺］和p、p’-DDE[2,2-双-(对氯苯基)-1,1-二氯乙烯]1.与受体直接结合（2）雌激素受体（ER）介导的反应这些化学品的效应与β-雌二醇（E2）等内源雌激素相似，包括DDT、烷基苯酚、双酚A等（一）影响机体正常内分泌功能的机制2：与生物体内激素竞争靶细胞上的受体通过竞争的结果，环境激素与靶细胞上的受体结合，减少受体对天然激素的吸附或阻碍天然激素与受体结合，从而减少了天然激素的作用。天然激素与受体的结合受环境激素的阻碍，进而影响激素信号在细胞、器官、组织的传递，导致机体功能失调。（一）影响机体正常内分泌功能的机制3：有些内分泌干扰物可产生类似雌激素的效应，却与雌激素受体的信号传递途径无关。芳烃受体（AhR）即为性激素受体外的一种信号传递途径，它可以与许多环境污染物如二恶英和呋喃结合，产生抗雌激素活性，包括增加雌激素代谢（降低内源雌激素水平）、降低雌激素受体ER的结合活性以及降低ER介导的基因表达等。（一）影响机体正常内分泌功能的机制•EDCs影响大脑皮层、下丘脑、脑垂体等对激素的调节作用，导致激素合成、释放、运输异常。如有机磷农药能与体内胆碱酯酶结合，形成稳定的磷酸化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去活性，丧失分解乙酰胆碱的能力，造成体内胆碱的蓄积，从而引起神经传导功能紊乱，出现一系列中毒症状。（二）影响神经递质的传导，毒害神经系统•金属铅和许多农药都对睾丸有较强的毒性作用；•在雌性生殖系统中，环境激素可以影响卵泡的发育和成熟、性激素的合成与释放。有机氯农药能使鸟类产蛋数目减少，蛋壳变薄和胚胎不易发育。(三)作用于生物体的生殖腺，影响性激素分泌环境毒物通过影响肝肾代谢功能，改变体内的激素水平。有机磷、有机氯农药可以诱导肝脏甾醇羟化酶、微粒体酶，从而加速内源性激素的代谢和排泄。艾氏剂和狄氏剂可使大鼠的谷丙转氨酶和醛缩酶的活性升高DDT对ATP酶有抑制作用。(四)作用于生物体的肝脏肾脏人的免疫系统在环境激素的长期作用下，会发生免疫失调和病理反应。Pb、Hg可使机体产生过敏性发病综合症；一些杀虫剂可引起免疫性溶血性贫血。(五)影响机体免疫细胞对抗原的识别（六）致癌、致畸作用•一些环境激素可作用于染色体，使其数目或结构发生变化，改变某些基因的序列，使得组织、细胞生长失控，产生肿瘤，如发生在生殖细胞，则可造成流产、畸胎或遗传性疾病；胎儿出生后体细胞遗传物质的突变易引起肿瘤。DEHP处理导致的子代小鼠无尾畸形右边个体为对照组箭头所示的红点处为本应长尾的位置25PerinatalExposuretothePhthalatesDEHP,BBP,andDINP,butNotDEP,DMP,orDOTP,AltersSexualDifferentiationoftheMaleRatEffectofDEHPontesticulardevelopment.研究范例L.EarlGrayJretal./TOXICOLOGICALSCIENCES58,350–365(2000)TestisweremalformationandstuntingafterDINPtreatmentLeft:Maternaltreatmentwithcornoil0.75g/kg/dayRight:MaternaltreatmentwithDINP0.75g/kg/dayComparedtocontroltestes,thisDINP-treatedmalerighttestesdisplayatrophictubulesthatlackanyevidenceofspermatogenesis.Inaddition,thelumenofboththeleftandrightcaudaeepididymidisfromthismalecontaincellulardebrisandreducednumbersofsperm.controlDINP27研究范例LeonE.Gray,Jretal./TOXICOLOGICALSCIENCES123(1),206–216(2011)Dose-ResponseAssessmentofFetalTestosteroneProductionandGeneExpressionLevelsinRatTestesFollowingInUteroExposuretoDEHP,DIBP,DIHP,DINP28Withthedrugconcentrationincreased,testosteronelevelsgraduallydecline.研究范例LeonE.Gray,Jretal./TOXICOLOGICALSCIENCES123(1),206–216(2011)研究范例LeonE.Gray,Jretal./TOXICOLOGICALSCIENCES123(1),206–216(2011)Insl3:胰岛素样因子3StAR:类固醇激素合成急性调节蛋白Cyp11A:细胞色素P450亚家族成员四、环境内分泌干扰物筛检方法（一）体内实验1.动物喂养实验2.啮齿动物切除卵巢后子宫肥大实验或动情期实验（二）体外实验1.雌激素受体竞争性抑制法2.标志基因鉴定301.动物喂养实验（一）体内实验31EDCs妊娠鼠皮下注射雄性子代后代不育情况成年后睾丸发育情况生殖腺损害情况通过测定EDCs对动物是否具有促进子宫生长的作用来评价其雌激素活性。该种实验直接作用于雌激素效应器，可以直接显示化学物的类雌激素功能。2.啮齿类动物切除卵巢后子宫肥大实验或动情期实验32动物实验的优缺点：优点：1.最具真实性2.最具说服力缺点：1.实验过程繁琐2.实验结果受动物年龄、性别、品系、个体差别及取样误差等影响3.对环境低浓度暴露不易获得正确结果（一）体内实验1.雌激素受体竞争性抑制法基于ELISA的受体竞争结合法检测环境雌激素方法：采用免疫测定介导受体竞争结合试验定量检测环境雌激素将17β-雌二醇-BSA固定在微孔板上，环境雌激素与微孔板上的17β-雌二醇-BSA竞争性的与雌激素受体结合，与微孔板上17β-雌二醇-BSA结合的受体与雌激素受体的抗体、雌激素受体抗体的二抗形成一个三明治形式的复合物，通过显色剂显色，最后用比色法对试验结果进行定量。结果：整个反应中环境雌激素浓度越高，溶液的吸光度值的变化就越小，环境雌激素的浓度与吸光度值成负相关。（二）体外实验34（1）酵菌转基因获得的性激素受体表达实验主要检测雌激素受体结合依赖性转录和转录活性。此法是用具有完整的人雌激素受体DNA的表达质粒和带有β-半乳糖苷酶结构基因上游的雌激素反应元件的标志质粒转化酵母菌—酿酒酵母菌形成激素依赖性转录活化因子，然后加入雌激素或待测的物质培养当雌性物质结合到受体上激活相应的激素反应元件合成β-半乳糖苷酶，利用酶-底物法检测其活性。2.标志基因鉴定人雌激素受体DNAβ-半乳糖苷酶结构基因上游雌激素反应元件待测物质有颜色显示无颜色显示•(2)质粒载体转染法构建含有由雌激素、雄激素或视黄酸应答的DNA加强元件的激素诱导控制下的莹虫酶基因的标志质粒载体，然后将这些载体短暂转染入含有相应受体的人类卵巢瘤BG-1细胞系中，显示它们同各自激素反应诱导莹虫酶的能力。2.标志基因鉴定3.细胞增殖实验人乳癌细胞（MCF-7）增殖实验实验原理MCF-7：激素依赖性细胞系，加入雌激素后诱导细胞增殖。实验结果判断比较在加入10%血清后的培养液中，加或不加E2或类雌激素物质培养后的细胞数量。研究实例Harris等利用此细胞系研究二噁英（TCDD）及其结构类似物对雌激素受体的影响，认为TCDD及TCDD类似物通过诱导CYP1A1基因表达而产生抗雌激素作用。39实验原理卵黄黄素：卵生脊椎动物幼年期由肝脏合成的雌激素依赖性蛋白前体，成年雌性体内含量极微或不能检出，但在雌激素或类雌激素物质作用下可过度表达。实验结果判断检测VTG或其mRNA含量即可判断该化合物有无雌激素活性或其作用强度。应用价值作为鱼、蟾蜍、爬行动物等卵生动物的雌性激素的一种生物标志，其诱导实验检测环境雌激素干扰物质暴露。4.卵黄黄素诱导实验•这种鉴定利用原代肝细胞受试，原代培养的细胞刚刚离体，其生物学特征未发生很大变化，保留了细胞的代谢活性，可最接近和反映体内生长特性。•这种鉴定的终点是雌激素反应蛋白或蛋