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5.分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术5.1重组DNA技术回顾分子生物学的三大成就：①40年代确定了遗传信息的携带者；②50年代提出了DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制；③60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，破译了遗传密码。重组DNA和核苷酸序列分析技术推动了分子生物学的发展，重组DNA的核心是用限制性内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease，RE）是能够识别DNA上的特定碱基序列（4~8bp，回文结构），并在识别位点或其周围切割双链DNA分子的一类内切酶，产生具有粘性末端或平末端的片段。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠEcoRⅤGATATCCTATAGGATCTAATCTAG+第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用斜写大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用斜写小写；第四个字母代表株，用小写；用罗马数字表示发现的先后次序。限制性内切核酸酶的命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶RE的一个活性单位（1U），是在50μl的反应液中，37℃下，经过1小时反应，将1μgDNA完全分解所需要的酶量。RE的浓度：5~20U/μl。Star（星号）活性：在非最适的反应条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、高pH值等），有些RE可能会切断与原来识别序列不同的位点，这种特殊的活性，称为Star活性。保存方法：50%甘油缓冲液中，保存温度-20℃，避免结冰。DNA的酶切反应1)建立反应体系2)轻弹外壁以混匀，并短暂快速离心，使液体沉下。3)将混合反应物置于37℃水浴锅中，反应1-3小时。4)电泳观察酶切结果。内切酶缓冲液DNA内切酶ddH2OM123421226bp5148bp2027bp1548bp1375bp947bp831bpTaKaRa（宝生物工程有限公司）限制性内切酶缓冲液成分(DTT)，二硫苏糖醇TaKaRa双酶切通用缓冲液使用表DNA连接酶（ligase）：通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，修复缺口或催化黏合完全分离的两个DNA片段。类型：大肠杆菌DNA连接酶、噬菌体T4DNA连接酶。连接反应1)建立反应体系，轻弹外壁以混匀，短暂快速离心，使液体沉下。2)4℃或16℃连接过夜。连接酶缓冲液酶切质粒DNA连接酶目的片段获得了外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA后，还要通过细菌转化将重组载体导入宿主细胞（E.coli），让重组载体增殖。转化E.coli获得目的基因片段（PCR），电泳回收；连入克隆载体，获得MCS或用于测序转化E.coli，提取重组质粒酶切或PCR鉴定重组子酶切表达载体和重组克隆载体连接目的基因和表达载体转化E.coli筛选重组子，提质粒鉴定重组子DNA重组过程5.2DNA基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5.2.3聚合酶链反应技术5.2.4实时定量PCR5.2.5基因组DNA文库构建5.2.1核酸凝胶电泳技术原理：某种分子放到电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。迁移率：这种分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数（分子大小、极性、介质黏度的函数）成反比。迁移率取决于分子大小和构型。分子量越大，迁移率越小。相同分子量的超螺旋环状DNA（cccDNA，SCDNA）迁移率＞线性DNA（LDNA）＞开环DNA（OCDNA）。类型：琼脂糖（agarose）凝胶电泳、聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成电泳介质，密度由其浓度决定。聚丙烯酰胺是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED（四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关，琼脂糖凝胶分辨的范围在0.2-50kb，要分辨更小的DNA片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，分辨范围1-1000bp。凝胶浓度高低影响其孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强。电泳缓冲液：TAE、TPE、TBE，作用：①稳定体系的pH值；②使溶液具有一定的导电性；③EDTA可螯合Mg2+，抑制DNA酶活性，还可防止Mg2+与核酸生成沉淀。载样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液。作用：①增加样品密度；②使样品带颜色；③可预测泳动速率。Marker：分子量不同的DNA片段，作用类似于标尺。步骤：封胶板，插梳子→配胶→加EB→灌胶→胶凝后拔梳，放入电泳槽，加缓冲液→加样→插电极→电泳→取胶→观察照相仪器设备：电泳槽、电泳仪、紫外分析仪（凝胶成像系统）。琼脂糖凝胶电泳中，加入适量溴乙啶（EB）染料，EB是扁平分子，能插入到核酸分子的相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。荧光强度与DNA片段的大小成正比。聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳后用硝酸银进行染色。Ag+先与核酸形成复合物，再用甲醛使Ag+还原为银颗粒而呈现黑褐色。脉冲场电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）对于50kb的DNA分子，用脉冲电场凝胶电泳进行分离。用交替变换方向的两个电场施加在凝胶上，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变，重新定向时间小于电场变化周期的DNA分子将按其大小被分离。可分离高达107的DNA分子，用于研究基因组、克隆和分析大的基因片段。acb5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。进入宿主细胞的外源DNA通过载体上的Ori进行复制增殖，使其能够在宿主细胞中保持下来，并能以完整的形式从细胞中分离纯化出来。细菌正常条件下仅能获取极少量的DNA，为了高效转化，必须对受体细菌进行理化处理，增加它们获取DNA的能力，处理过的细胞称为感受态细胞。CaCl2法是制备感受态细胞最常用的化学方法，E.coli→低温预处理的CaCl2溶液中，造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相黏附。转化方法：CaCl2法（热击法）和电击法。热击法：连接液→E.coli感受态细胞→冰上→42℃短暂热刺激，外源DNA被细胞吸收。电击法：用电融合仪，E.coli→电极杯，12.5-15kV/cm、5ms的电脉冲可在细胞膜上造成孔洞，介质DNA通过孔洞进入细胞质。经过转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。筛选方法：抗生素筛选和蓝白斑筛选。抗生素筛选的原理：利用质粒上的抗生素抗性基因。蓝白斑筛选的原理：载体带有lacZ基因，编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端，宿主细菌编码羧基端，细菌和质粒编码的片段都不具有酶活性，通过片段互补形成具有活性的β半乳糖苷酶。α互补：α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补。IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）筛选出阳性克隆→提质粒→鉴定5.2.3聚合酶链反应（PCR）技术PCR是英文polymerasechainreaction的缩写，中文译名是聚合酶链式反应，是一种体外DNA快速扩增技术。KaryMullis原理：类似于DNA的体内复制过程。模板双链单链90～97℃步骤1：变性一对引物40～60℃步骤2：复性DNA聚合酶dNTP72℃步骤3：延伸高温变性-低温复性（退火）-中温延伸的过程就是一个PCR循环。每次循环约2~4分钟，2~3小时可获得待扩增片段上亿个拷贝。反应体系1)模板：基因组DNA、片段、cDNA、质粒，1pg~1μg2)引物：与模板互补的寡核苷酸，起动新链合成，0.1~1μmol/L3)酶：DNA聚合酶（Taq酶）4)dNTP：标准浓度200μmol/L5)Mg2+：0.5-2.5mmol/L6)Buffer：50mMKCl、10mMTris-HCl7)ddH2OPCR的特异性取决于引物与模板互补的程度。引物用软件设计，常用Primerpremier5.0。设计原则①长度：常用18-24nt；②GC含量：40-60%；③引物自身不存在互补序列，引物之间也无互补性；④引物与非扩增区无同源性；⑤3’端不能进行修饰，5’端可加酶切位点。上游引物：5’-acacagccatcggtccagac-3’下游引物：5’-atcttagccagacgagcggg-3’引物合成：生物公司，干粉→溶解分离：1969年，美国黄石国家公园温泉，嗜热水生菌（Thermusaquaticus）。分子量：94KDa，832个氨基酸。特点①良好的耐热性；②Mg2+依赖性；③无校正功能，出错率为2×10-4个核苷酸/每轮循环。④聚合速度为1~2kb/min。⑤有非模板依赖的聚合活性。反应条件1)94℃预变性5～10min；2)94℃变性30～60s；3)45～60℃复性30～60s；4)72℃延伸60～90s；5)72℃终延伸5～10min；6)4℃终止反应。结果：用凝胶电泳检出。25-35个循环反应中的对照阳性对照：用于检测PCR的效率，用阳性质粒或DNA做模板。阴性对照：用于检测有无DNA的污染，反应中不添加模板，通常用水代替模板。反应中可能出现的问题不出现扩增条带假阳性：设立对照出现非特异扩增带平台效应PCR反应中，当引物-模板与Taq酶达到一定比值时，Taq酶催化的反应趋于饱和，出现平台效应（平台期、停滞效应），即反应产物不再增加。平台效应出现的时间取决于起始模板量、扩增效率、酶的活性、dNTP浓度、引物质量等多种因素。后果：非特异性产物增加。5.2.4实时定量PCR需要检测特定基因的表达水平，经常用到定量PCR，用一种标准作对照估计出特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。由于PCR扩增以指数方式进行，一个循环中的扩增效率出现小差异都能够导致最终产物总量上的大差异。扩增产物总量的变异系数可达到10-30%，用简单的方法对扩增产物进行定量是不可靠的。实时定量PCR技术：利用带荧光检测的PCR仪对扩增过程中扩增产物的积累速率绘制动态变化图，实现对扩增产物的定量分析。在反应中引入一种荧光化学物质，随着反应进行，产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。非序列特异性的荧光探针：SYBRGreenⅠ与目的序列特异结合的荧光探针：TaqMan探针520nm激发光三个要素：5’端短波长荧光基团目的DNA特异序列（50-150bp）3’端长波长荧光基团结果分析：设阴性对照和4个以上标准品，每个样品3次重复。以10-15个循环的荧光值或阴性对照荧光值的最高点作为阈值或基线。Ct值：产物荧光强度首次超过阈值时，PCR所需的循环数。通过实时定量PCR，可以对野生型（正常品种）和突变体中基因表达的变化进行定量比较。拟南芥野生型中WUS基因平均Ct值：31.23±0.32突变体中平均Ct值：21.92±0.13差值⊿Ct：9.31±0.19设定实验中PCR扩增效率为1.8，WUS基因在突变体和野生型中表达丰度的比值为1.8⊿Ct=239±26.255.2.5基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆；包含基因组中所有DNA序列的克隆的总汇，称为基因组DNA文库。用途：分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱、进行全基因组序列测定。基因组文库要具有一定的代表性和随机性。文