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细胞的冻存和复苏细胞的冻存的必要性冻存的原理•为使细胞复苏时存活率最高•最佳的冻存条件：尽可能地降低细胞内的晶体形成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。–A)缓慢冷冻–B)用亲水的低温保护剂排除水分–C)在尽可能低的温度保存细胞–D)快速复苏1.缓慢冷冻：大部分培养细胞以1ºC/min降温时冷冻存活率最高。常用方法4ºC离心收集细胞细胞在冷的冻存液中悬浮冰上5min-20ºC冰箱30min-80ºC冰箱过夜液氮罐长期保存2.用亲水的低温保护剂排除水分在冻存液中加入细胞保护剂甘油或DMSO（二甲基亚砜）后进行冷冻。DMSO相对于甘油而言：穿透细胞的能力强，保护作用好。但有一定毒性，对某些细胞可能会诱导细胞分化。细胞冻存所用培养基细胞生长用培养基细胞冻存用培养基RPMI-164059%碳酸氢钠青、链霉素1%血清（FBS）30%DMSO10%以较高的细胞浓度冻存细胞，细胞的存活率会高一些。用血球计数板计数细胞•目的：量化细胞的浓度•应用：传代中标准化细胞的浓度；生存率的检测•检测潜在的损伤•基于细胞膜的完整性被破坏•最常用的是“染料排斥法测定细胞生存率”•常用染料为：台盼蓝、藻红和萘黑•注意：染料与细胞混合后不要放置很久（5-10min），否则活细胞会受到损伤而吸收染料。1.将细胞悬液滴到血细胞计数板小室的边缘，盖上盖玻片；（利用毛细作用使之充满计数板和盖片间的空隙。小室内的液体既不能多，也不能少）2.把计数板平放在显微镜载物台上；3.选择一个10X的物镜，利用网格线对焦；4.移动计数板，使镜下的视野恰好是整个网格区域中心的一个大方格（1mm2）1mm5.为了避免重复计算，压线的细胞只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。计数的细胞越多，计算的结果越准确。若要进行需精确定量的实验，所数的细胞数应在500~1000个。（a）如果视野内的细胞过少（100/mm2），需要额外计算中心大方格周围的一个或多个大方格（每个方格1mm2）。（b）如果视野内的细胞过多（1000/mm2），只需计算大方格（1mm2）对角线上的小方格。细胞样品浓度的计算计算公式：C=n/v•C是细胞浓度（细胞数/ml)•n是数过的细胞数•v是被计数的细胞体积（ml）血细胞计数室通常是1mm2X0.1mm深为1X10-4ml最终公式为：C=nX104同时需要考虑悬浮细胞所用的总的ml数和样本的稀释倍数。实验步骤（细胞冻存）用品器材超净工作台内：（共享）污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、微量移液器和枪头（5ml、1ml和50ul各一）（每人）空EP管2个、1640培养基（0.75ml）、胰酶（0.75ml）、Hank’s液（H，1ml）、冻存液（锡纸，1ml）、冻存管1只、无菌袖套教室：枪头（50ul）、0.4%台盼蓝溶液、血细胞计数板、盖玻片教室对面：离心机本次实验的实验步骤一（每人做一份）•操作台内去除培养基，1mlHanks洗细胞，再用胰酶（0.9ml）消化细胞；（如何？）•加入0.9ml完全培养基中止消化；•吹打；（充分地混匀细胞悬液使之尽量分散成单个细胞；尽量减少气泡的产生）•转入空2mlEP管（A）；•从中取20ul细胞悬浮液，放入另一个1.5mlEP管（B）；•两只EP管盖好后，拿出无菌操作台；•EP管做好标记无菌操作室教室对面:将EP管（A）配平后，放入离心机，4ºC，1000g，10min离心实验步骤二无菌操作室将EP管A离心后，小心带回无菌操作台，去上清；余下的细胞沉淀，加入0.5ml细胞冻存液，使细胞悬浮，转入细胞冻存管；冻存管上做好标记；放入无菌准备间中的冰盒5min；放入-20ºC，30min；放入-80ºC过夜；液氮长期保存。教室EP管B：在20ul细胞悬浮液中加入20ul0.4%TrypanBlue,快速混合后，取20ul滴在血球计数板的计数小室上方，盖上盖玻片，开始计数；计算出细胞悬浮液的浓度，细胞生存率（实验报告上应有的数据）去盖玻片，将血球计数板冲洗干净交老师。实验步骤（冻存细胞的复苏）用品器材超净工作台内：（共享）污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、5ml移液器及枪头、枪架、1640培养基（每人）培养瓶、无菌袖套本次实验的实验步骤一（每人做一份）•取冻存管（在干冰上，请注意安全！）•37ºC水浴3min无菌操作室准备间无菌操作室•冻存管酒精消毒•用吸管吹打一次，使细胞悬浮•细胞悬浮液转入培养瓶•培养瓶中加入3ml培养基，盖好瓶塞，取出培养瓶，做好标记，37ºC培养。24小时给细胞换液•取细胞，显微镜下检查显微镜室无菌操作室•培养瓶酒精消毒•用吸管吸走旧培养基•培养瓶中加入3ml新培养基，盖好瓶塞，取出培养瓶，显微镜下检查（绘图），37ºC培养。