实验九 石蜡切片制作

一、实验目的与要求：掌握石蜡切片制作的基本过程及其注意事项。二、实验材料和仪器：实验材料:向日葵幼茎、石蜡、酒精、二甲苯、番红/固绿染色液等；实验仪器和器皿：石蜡切片机、展片机、染色缸、载玻片、盖玻片等。三、实验内容与方法：1.观看石蜡切片切片制作录像。2.制作向日葵幼茎石蜡切片。四、作业：提交制作合格的向日葵幼茎石蜡切片。实验九石蜡切片制作石蜡制片的基本步骤1.取材2.杀死与固定3.脱水4.透明5.浸蜡与包埋6.切片7.粘片与烤片8.脱蜡与复水9.染色10.切片脱水、透明和封固1.取材1.1材料来源及部位。①种类②部位③发育阶段④是观察横切面还是纵切面？1.2取材原则：动作：快，轻，用力均匀体积合适刀要锋利2.杀死与固定目的---杀死各种酶，保持细胞的结构固定液固定时间固定后的处理最常用的固定液为FAA。固定时间不受限制，短则数小时，长可延至数月或数年。配方：50％或70％酒精90毫升冰醋酸5毫升福尔马林5毫升柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。•卡诺氏(Carnoy’s)固定液：有极强的渗透力•固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不能超一天)。•固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配法有两种：固定组织时应注意：①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。④抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。组织固定后的处理①冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。②材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。③通常在冰箱中4℃存放。3.脱水•水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。•凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。•酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从低浓度到高浓度递增的顺序进行.•30%--50%---70%---85%---95%--100%---100%每步30-60分钟左右。要求及注意事项•保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。•不同大小的组织块脱水时间不同。•不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩）•在50%酒精中加入曙红，用于染色。•材料可以放在70％酒精中保存。•正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。4.透明•纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。•常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。•通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。•材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。•透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。5.浸蜡与包埋•用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。•通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时或者过夜，再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天。•浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。•石蜡熔点：45-50℃软蜡55-60℃硬蜡材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；切片较薄时（在8微米以下），用熔点较高的石蜡包埋；夏季采用熔点较高的石蜡（56,58）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52,54）。•石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去除杂质。加5%～10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。•程序：在溶蜡箱中进行，55-60℃，恒温。•浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯︰石蜡（1︰1）中1次，在石蜡中2次，每次1-3天左右。•包埋：在室温进行6.切片•包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上。•切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。•通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。7.粘片与烤片•用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。•在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入42℃温箱中干燥。常用的粘片剂为郝伯特(Haupt)粘贴剂：甲液：明胶1克蒸馏水100毫升甘油15毫升苯酚2克乙液：甲醛4毫升蒸馏水100毫升8.脱蜡及复水干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。•脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二甲苯溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。•复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（100%）开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常是30%酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果不经过复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。•顺序：二甲苯→1/2二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色以上各级约需5～10分钟。9.染色•染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。•经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。•根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法。•番红与固绿染色法•番红用l％的水溶液，固绿用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)•染色步骤如下：10.切片脱水、透明和封固•染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。•封固剂：加拿大树胶（Canadabalsam）或中性树胶•将载玻片从二甲苯中取出，务必使有材料的一面朝上。•迅速在材料上加适量封固剂（不能使二甲苯干很久后才封片），盖上干净的盖玻片。•切片放入42℃温箱中干燥过夜。•镜检，将合格的切片贴上标签。向日葵幼茎横切片