临床检验基础实验指导

1临床检验基础学实验指导血液常规检验一、微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定与使用【实验目的】：掌握微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定、构造与使用。【实验试剂】：红细胞稀释液、75％乙醇、消毒药棉。【实验器材】：一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。【实验原理】：一次性采血针刺破毛细血管后，用微量吸管吸取一定量的血液，稀释一定的倍数，冲入计数池计数一定体积内的细胞的数量。【实验方法】：一、微量吸管的使用：用抗凝血训练微量吸管的使用。二、毛细血管采血（以红细胞计数为例）：准备：取清洁干燥试管一支，加2ml红细胞稀释液。采血部位选择、按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干（否则血流不成滴）→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取10ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→轻轻混匀。三、计数板构造与应用1．计数板构造外观构造：每块计数板由“H”型凹槽分上下两个计数室，在计数室两侧各有一条支柱，比计数室高出0.1mm，将一块平整光滑的血细胞计数专用盖玻片（24.0mm×20.0mm×0.6mm）覆盖其上时，盖玻片与计数室间形成0.1mm的缝隙。2格子构造：计数池长、宽各3mm，平均分成9个大格，每个大方格的容积是0.1mm3四角的四个大方格分别用单线划分成16个中方格，是白细胞计数区域；中央的大方格用双线条划分成25个中方格，每个中方格又用单线划分成16个小方格，其中四角和正中的5个中方格是红细胞计数区域。2．计数板的使用：用清洁干燥柔软的纱布擦拭计数板及盖玻片→用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上→充分混匀细胞悬液→充池→静置→观察细胞分布情况（若严重不匀，应重新充池。）【注意事项】：1．采血部位应选择皮肤完整，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2．针刺应迅速，深度适宜（约2－3mm）。待血液自行流出，擦去第一滴血。3．微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。若血流不暢，可以左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出为止。切忌用力挤压，造成组织液混入，影响结果准确性。4．计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片表面，以访油腻污染，致使充液时起泡。二、血涂片的制作,瑞氏染色【实验目的】：掌握血片制作方法，瑞氏染色原理及方法。【实验试剂】：瑞－吉氏复合染液（Ⅰ液、Ⅱ液）【实验器材】：显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球【实验原理】：细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用，不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲和力也不一样，因此将细胞染成不同的颜色。【实验方法】：一、瑞一吉氏复合染液配制3Ⅰ液：取瑞特染粉1g，吉姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯），研磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色瓶中，每天早晚各振摇3′共5天，再存放一周，将染液过滤后即可使用。Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（PH6.5—6.8），取磷酸二氧钾（无水）6.64g，磷酸氟二钠（无水）2.56g，加少量蒸馏水溶解，调整PH后，加水至1000ml。二、血片制作、瑞氏染色方法准备：取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。1、制备血涂片：取载玻片→取血1滴于载玻片右端（边缘留1.5cm空隙）→左手持载玻片，右手持推玻片→将推玻片放至血滴前沿逐渐后移至血滴沿推片散开后，推玻片与载玻片成30°～35°的夹角以平稳的速度将血液向前推进→干燥（手持载玻片末端迅速在空气中挥动干燥）。2、染色：将干透的血涂片放在水平位置→加瑞吉氏复合染液Ⅰ液数滴，以染液覆盖整个血膜为度→静置染0.5～1min→滴加约2倍于Ⅰ液量的Ⅱ液→用洗耳球吹气混匀→染色5－10min→平持玻片用流线型水洗→干燥→镜检【注意事项】：1．严格皮肤消毒。2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。3.染料放置时间越长，美兰逐渐氧化为天青，染色效果越好。4．染液淡，室温低，细胞多则染色时间长，反之减少染色时间。5．水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净，不要先倒掉染液。4三、白细胞计数（WBC）【实验目的】：掌握白细胞计数的原理、操作方法与结果报告。【实验原理】：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。【实验试剂】：白细胞稀释液【实验器材】：显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】：准备：取清洁干燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。采血部位按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干（否则血流不成滴）→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→室温静置至液体变为棕褐色即红细胞破坏完全→清洁计数板、盖玻片→充池→静置2－3min待细胞下沉→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→计算→报告。计算：WBC=四个大方格内的白细胞数（N）/4×10×20×106=N/20×109/L【注意事项】：1．采血部位应选择皮肤完整，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2．针刺应迅速，深度适宜（约2－3mm）。待血液自行流出，擦去第一滴血。3.稀释液要过滤使用，试管、计数板均须清洁，以免混入杂质被误认为白细胞。4.加稀释液、血液量应精确，以保证稀释倍数。5.计数池内细胞分布要均匀，每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的±10％，否则要重新充液计数。56.严格掌握计数原则，以免人为扩大或缩小计数区域。7.白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或加大取血量。四、白细胞分类计数（DC）【实验目的】：掌握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白细胞的镜下形态。【实验原理】：将血液制备成涂片，经瑞－吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：瑞－吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：血涂片制备及瑞－吉氏染色待干低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域→转油镜按一定的规律移动视野，依次进行分类计够100个白细胞→算出各种白细胞的百分比→报告【注意事项】：1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。2.分类时要有程序地连续进行，避免主观选择视野。3.分类中如见幼红细胞，不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞过程中见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段，4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况，注意有无寄生虫（如疟原虫）及其他异常所见。6五、白细胞计数（WBC）及分类计数(DC)【实验目的】：掌握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告【实验原理】：白细胞计数原理：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。白细胞分类计数原理：将血液制备成涂片，经瑞－吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：白细胞稀释液、瑞－吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：1.取清洁干燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。2.取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。采血部位按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干（否则血流不成滴）→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→另取血一滴于载玻片的右端→立即推制血膜→用无菌干棉球压住伤口止血→清洁计数板、盖玻片→充池（静置2－3min待细胞下沉）→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→将干透的血膜进行瑞－吉氏染色→油镜下分类计数→计算→报告。六、红细胞计数（RBC）、Hb测定7【实验目的】：掌握红细胞计数，Hb测定原理、操作方法，规范的报告结果【实验原理】：红细胞计数原理：用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求得内升血液中的红细胞数。Hb测定（HiCN法）原理：血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定地氰化搞铁血红蛋白（HiCN），HiCN在规定波长（540nm）和液层厚度（1cm）的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。可用标准的高精度分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【实验试剂】：红细胞稀释液（甲醛枸木缘酸盐稀释液），HiCN转化液【实验器材】：改良Neubauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、【实验方法】：RBC：取清洁干燥试管一支→加红细胞稀释液1.99ml→加未梢血10ul于稀释液底部→吸取上清液嗽洗3—4次→颠倒混匀→清洁计数板，盖玻片→充液→静置2′—3′→计数（中央大格中四角及正中5个方各细胞数）→计算RBC=5个中方格细胞数×5×10×200×106=5个中方格细胞数×1012/L。Hb测定:1.直接定量测定法：取中号试管一支→加HiCN转化液5ml→加未梢血20ul→混匀静置5′→721比色，波长540nm，以转化液为空白对照管→测其吸光度“A”→计算（“A”×367.7）→报告2.标准曲线法：8将血红蛋白标准液稀释成不同的三种浓度（150g/L、100g/L、50g/L）分别测其吸光度“A”，以“A”为纵坐标，血红蛋白标准液参考值（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过渡挤压，红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。2.HiCN转化液应置棕色瓶于4℃冰箱中，不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下，否则会使CN－丢失，结果偏低。3．HiCN转化液中有氧化钾剧毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm时，测定温度为20℃～25℃。七、血液常规检验【实验目的】：掌握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。【实验原理】：见实验二、三、四、六【实验试剂】：红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞－吉氏复合染液、HiCN转化液【实验器材】：改良Neubauer计数板、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。【实验方法】：取大、中、小号试管各一支→分别加HiCN转化液5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液0.38ml→手指消毒针刺→分别取未梢血10ul于红细胞稀释液中、20ul于白细胞稀释液中、20ul于HiCN转化液中→并及时混匀→取清洁干燥玻片粘取1滴血液于玻片一端→推制血片→待干→721比色→瑞氏染色→白细胞及红细胞计数→DC→计算→报告（血常规结果报告）9正常值：成人儿童新生儿1.WBC:（4－10）×109/L（5－12）×109/L（15－20）×109/L成年男性成年女性儿童2.RBC:（4－5.5）×1012/L(3.5-5)×1012/L(6-7)×1012/L3.HB:120-165g/L110-150g/L170-200g/L4.DC:N:杆状1－5％分叶50－70％L：20－40％M：3－8％E：0.5－5％B：0－1％【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过度挤压。2．HiCN转化液中有氧化钾巨毒，防止污