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结核分枝杆菌实验室检测方法主要内容一、结核杆菌的病原学基础二、结合分支杆菌全球的流行情况三、结核杆菌的实验室检测方法及临床应用一、结核病的病原学基础•结核杆菌属：一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fastbacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致病性等密切相关。本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类：结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌；按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌三种类型结核分枝杆菌群•结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包括人结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti），前三种对人类治病，其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。•结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌•及时准确的诊断结核病，有效地控制传染源，对预防结核病至关重要。结核病实验室检查细菌学检查免疫学检查分子生物学检查涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定最原始最基础的检测方法涂片染色镜检抗酸染色的原理•分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质。包围在肽聚糖的外面，所以分支杆菌一般不易着色，需要经过加热或是延长染色时间来促使其着色。但分支杆菌中的分支菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。涂片染色镜检临床价值适用于多种标本；操作简便，价格低廉。涂片镜检的临床应用一、确诊涂阳结核病及开放性结核2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+影像学检查符合活动性肺结核表现。涂片镜检的临床应用二、肺结核治疗评估的主要依据之一治愈：涂阳肺结核患者完成规定疗程，连续2次涂片结果阴性，其中1次是治疗末的涂片。治疗失败：新涂阳患者治疗第5个月末或疗程结束时，痰涂片检查阳性，涂阴肺结核患者治疗过程中任何1次痰菌检查阳性，均为治疗失败。缺点：不能区别结核分枝杆菌和非结核分支杆菌不能区别死菌跟活菌。结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。检测灵敏度较低（104-105个细菌/毫升）。分枝杆菌分离培养结核菌培养仍是目前诊断结核病的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用,是鉴定是否为活菌的可靠方法．传统的固态培养法需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。快速培养法:检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观察、变色液体培养基等。快速培养法阳性的报告时间大概是1—3周左右，比传统的固态培养法快，但是仪器价格太昂贵。确诊结核病1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性即可确诊。痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性结核菌培养临床价值用于耐多药结核疗效判定治愈：（1）患者完成疗程，且在疗程的后12个月，至少最后5次痰培养（每次间隔至少30天）连续阴性。（2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔至少30天）最少连续3次阴性。失败：治疗的最后12个月，5次痰培养中有两次或两次以上阳性；或者在最后的3次，培养中有任何一次是阳性。分离培养的优点敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。分离培养的缺点需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响，操作较直接涂片法复杂，需经严格培训，对实验室要求也是较高。成本是直接涂片法的7-8倍。结核病实验室检查细菌学检查免疫学检查分子生物学检查涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学检查细胞免疫学检查体液免疫学检查（血清学检查）•结核抗体测定•结核抗原测定•循环免疫复合物测定血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis.血清学检测的评价原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1。结核病细胞免疫学检查•结核菌素皮肤实验•蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)迟发型细胞超敏反应1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左前臂屈侧中部皮内注射，48～72h测量皮肤硬结的直径。结核菌素实验（PPD试验）2）判断标准：阴性≤4mm弱阳性5-9mm阳性10-19mm，强阳性≥20mm或局部出现水泡与坏死3)结核菌素试验的意义阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性：活动性结核病可能A、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异性较差。当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。PPD试验临床价值•结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。•由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。•基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。•目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：•早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）•培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）T-SPOT®.TB临床性能指标•特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)•灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)实验结果的解释•阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全患者•阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：①4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）方法学的优点•检测特异性的提高–帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药•检测灵敏度的提高–有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散•快速–48小时出结果方法学的局限•不能区分活动性TB与潜伏感染•不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断•目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者•不适合用于结核病患者治疗的疗效监测•检测收费高（600-700元/次）体外r-干扰素释放试验活动性结核病通过有效的抗结核治疗后，结核杆菌载量下降，效应T细胞数量会随之减少，所以理论上IGRA结果应从阳性转变为阴性，但临床实践中发现IGRA结果转阴率非常低。2012年发表的一篇meta分析中指出，T-SPOT.TB在结核病患者抗结核治疗后转阴率为5.71%-13.93%，说明IGRA在评价抗结核治疗方面作用是有限的。ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-γreleaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,2012,34:1041-1048.IGRA在评价抗结核治疗中的作用是有限的结核病实验室检查细菌学检查免疫学检查分子生物学检查涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学诊断细胞免疫学诊断聚合酶链反应（PCR）DNA测序DNA探针技术基因芯片技术分子生物学检测方法•近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天甚至是几个小时。研究、应用报道较多的结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。实时荧光PCR技术•本实验室所使用的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）采用单管单人份的分装技术，操作过程非常简便；并引入荧光检测技术，简化了检测步骤，并且整个扩增及扩增后检测都无需打开扩增管盖，从根本上克服了PCR遗留污染。荧光探针PCR检测技术综合了PCR扩增的高敏感性、探针杂交的高特异性及荧光能量转移的实时跟踪特性，使检测的准确性大大提高，并可充分保证检测的稳定性及重复性。结核杆菌PCR检测的临床意义•1.在痰菌阴性结核快速诊断有重要临床应用价值。•在临床工作中，痰菌阴性，经临床综合分析后诊断为肺结核的患者，约占肺结核患者的60%-70%。有报道指出痰菌阴性的肺结核患者，如果未经抗结核治疗，经过1-3年的随访，将有40%-60%的患者发展为菌阳甚至更典型的肺结核。所以获得病原学的诊断至关重要结核杆菌PCR检测的临床意义•2012年发表在中国防痨杂志中的一篇文章的研究指出在476例菌阴肺结核病患者中，PCR法检出116例阳性，检测的灵敏度为24.4%•而菌阳肺结核患者的检测灵敏度为97.0%结核杆菌PCR检测的临床意义•2、PCR法可以作为临床痰涂片和痰培养的补充，为临床诊断和治疗提供帮助•涂片阳性并不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌，这两者的治疗是有很大的差异的，NTM对于常用的抗结核药经常都是无效的，所以对于涂片阳性的标本，很有必要在在做MTB