机制1胰凝乳蛋白酶催化胜肽键水解

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歐亞書局CH6酵素6.4酵素反應的例子要了解一個經過純化酵素的完整催化機制,還必須確知其所有的受質、輔因子、產物及調節因子。除此之外,尚需知道以下資訊:(1)在酵素反應中,與酵素結合的各種中間物之出現時序。(2)每個中間物及每個過渡狀態的結構。(3)中間物間的相互轉換速率。(4)酵素與每個中間物之間的結構關係。(5)所有反應及作用官能基,對中間物複合體與過渡狀態貢獻的能量。p.218歐亞書局CH6酵素胰凝乳蛋白酶的作用機制涉及絲胺酸殘基的醯胰凝乳蛋白酶的3D立體結構如圖6-18所示,其強調的重點在於活性部位的官能基。此酵素的催化反應闡述了如何穩定過渡態的原理,並提供了對於一般酸-鹼催化及共價催化一個經典的例子。p.218歐亞書局CH6酵素圖6-18(a)p.219圖6-18胰凝乳蛋白酶的結構(PDBID7GCH)。(a)一級結構的圖示標出雙硫鍵及對催化力具決定性的胺基酸殘基。此蛋白質是由三條以雙硫鍵相連結的多肽鏈所組成(圖中編號14、15、147及148殘基缺口的部分會在圖6-38說明)。活性部位的胺基酸在三級結構中是聚在一起的。歐亞書局CH6酵素p.219圖6-18胰凝乳蛋白酶的結構(PDBID7GCH)。(b)強調此酵素表面的圖示,與受質的芳香族胺基酸支鏈結合的口袋狀位置以綠色表示。而主要的活性部位殘基包括Ser195、His57及Asp102是以紅色表示,這些殘基對於催化反應的角色在圖6-21有作說明。圖6-18(b)歐亞書局CH6酵素p.219圖6-18胰凝乳蛋白酶的結構(PDBID7GCH)。(c)多肽鏈骨架以帶狀結構表示,雙硫鍵為黃色圖示,而A、B、C鏈與(a)圖用相同的顏色顯示。圖6-18(c)歐亞書局CH6酵素p.219圖6-18(d)受質歐亞書局CH6酵素p.219圖6-18胰凝乳蛋白酶的結構(PDBID7GCH)。(d)受質(綠色)與活性部位結合情形的近觀。從圖中可看見活性部位內其中兩個殘基Ser195及His57(皆為紅色)。Ser195的羥基會攻擊受質的羰基(紫色為氧原子);如圖6-21所示,氧分子上的負電荷會被氧負離子洞(oxyanionhole)(醯胺氮,其中之一來自Ser195,橘紅色)所穩定,而受質的芳香族胺基酸支鏈和其(即將)被切斷的胜肽鍵醯胺氮(圖中的朝外突起,並顯出受質其餘被切開的多肽鏈的投影走向)以藍色表示。歐亞書局CH6酵素p.219圖6–19歐亞書局CH6酵素p.219圖6–19(續)歐亞書局CH6酵素p.219圖6-19醯基-酵素中間物的前穩態動力學證據。藉由對位-硝基苯酚(有色的產物)的釋放來觀察胰凝乳蛋白酶水解對位-硝基苯醋酸鹽的情形。剛開始時,對位-硝基苯酚是以非常快的速度被釋放出來,快速釋出的量與使用酵素的量差不多相等,這反映出反應中快速醯化的階段。接著反應速率變得較慢,是因為酵素的轉換受限於較慢的去醯化反應階段之故。歐亞書局CH6酵素胰凝乳蛋白酶的作用機制另一特徵是反應時的pH值決定其催化能力。藉由動力學及酵素結構的分析顯示,kcat數值的改變曲線反映了His57離子化的狀態。在pH值低時,kcat值下降是因His57的質子化(因此在反應第①步驟時,它無法從Ser195獲得質子;見圖6-21)。此時反應速率降低顯示出一般酸催化及一般鹼催化對於胰凝乳蛋白酶作用機制的重要性。p.220歐亞書局CH6酵素p.220圖6–20歐亞書局CH6酵素p.220圖6-20胰凝乳蛋白酶的催化反應與pH值的關係。(a)胰凝乳蛋白酶催化水解受質的速率對pH值作圖得到鐘型的pH-速率圖,最高的反應速率是在pH8.0時。繪製所使用的速率(v)是在低受質濃度的情況下所測得的,因此此反應速率v代表kcat/Km。利用動力學的方法,此圖可被分解成它的組成(kcat和Km)。在每一個pH值之下分別測定kcat和Km值。完成後結果如(b和c),可以很清楚的看出在pH7左右的轉變是由於kcat的改變,而在pH8.5左右的轉變則是因為1/Km的改變。由動力學以及結構上的研究顯示(b)和(c)圖解的轉變分別取決於His57支鏈離子化的狀態(當沒有鍵結受質時),以及Ile16的α-胺基離子化的狀態(在B鏈的N端)。此酵素要得到最高的反應活性,His57必須未質子化且Ile16必須質子化。歐亞書局CH6酵素在胰凝乳蛋白酶中,Ser195會與His57和Asp102形成氫鍵網絡,此稱為催化三角(catalytictriad)。當胜肽受質結合胰凝乳蛋白酶時,構形的微弱改變會擠壓His57和Asp102之間的氫鍵,導致產生更強的交互作用,稱為「低障氫鍵」。p.220歐亞書局CH6酵素BOX1-2FIGURE1p.221BOX6-3酵素與過渡狀態互補的證明歐亞書局CH6酵素BOX1-2FIGURE1p.223BOX6-3(續)酵素與過渡狀態互補的證明歐亞書局CH6酵素己醣激酶與受質結合時引起誘導配合己醣激酶是誘導配合的一個非常好的例子(圖6-22)。誘導配合只是己醣激酶催化作用機制的一部分,就如同胰凝乳蛋白酶,己醣激酶會利用好幾種催化策略。p.222歐亞書局CH6酵素p.224圖6–21歐亞書局CH6酵素p.224圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.224圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.225圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.225圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.225圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.225圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.224圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.224圖6–21(續)歐亞書局CH6酵素p.224機制圖6-21胰凝乳蛋白酶催化胜肽鍵水解。反應分為兩個時期,在醯化階段時(步驟到),胜肽鍵斷裂同時生成共價之具酯化酵素形態之中間物。在去醯化階段(步驟到),去醯化再產生游離酵素,基本上是醯化階段之反應的逆反應,只是由水分子以相反方向的方式,取代受質胺基的角色。歐亞書局CH6酵素p.226圖6-22己醣激酶的誘導配合。(a)己醣激酶具有U字型結構(PDBID2YHX)。(b)與D-葡萄糖(紅色)結合時誘發構形上的改變,導致酵素的兩端相對嵌合(源自PDBID1HKG與PDBID1GLK)。圖6–22歐亞書局CH6酵素烯醇酶反應機制需要金屬離子參與烯醇酶反應可說明一種金屬離子催化作用的形式,也是一種一般酸-鹼催化及如何穩定過渡狀態的例子(圖6–23)。溶菌酶利用兩個連續的親和性取代反應溶菌酶是一種在眼淚和鳥蛋的蛋白中發現的天然抗菌劑。p.226歐亞書局CH6酵素p.226機制圖6-23烯醇酶催化的兩步驟。(a)烯醇酶促使2-磷酸甘油酸(2-PGA)轉變成磷酸烯醇丙酮酸。2-PGA的羧基會與活性部位內的兩個鎂離子作用。圖6–23(a)歐亞書局CH6酵素p.226機制圖6-23烯醇酶催化的兩步驟。(b)受質2-PGA在烯醇的活性部位內和Mg2+、Lys345和Glu211相關位置圖。氫原子未標示出,所有2-PGA上的氮原子以藍色標示,磷的標示為橘色(PDBID1ONE)。圖6–23(b)歐亞書局CH6酵素p.227圖6-24雞蛋白的溶菌酶及其催化反應。(a)酵素帶狀的結構圖:活化區殘基Glu35與Asp52以藍色桿狀結構表示;紅色代表其結合的受質(PDBID1LZE)。圖6–24(a)歐亞書局CH6酵素p.227圖6–24(b)歐亞書局CH6酵素圖6-24雞蛋白的溶菌酶及其催化反應。(b)雞蛋白溶菌酶的催化反應。此處顯示肽聚糖聚合體的片段與溶菌酶的結合區A至F(網點陰影處)。結合至D與E的糖類殘基間之糖苷C─O鍵結處被切斷(紅色箭頭指示處)。水解反應顯示於插入的圖中,水分子的氧以紅色標示,以顯示其動向變化。Mur2Ac為N-乙醯胞壁酸;GlcNAc,N-乙醯葡萄糖胺;RO─代表乳醯(乳酸)基;─NAc與AcN─為N-乙醯基(見方框中關鍵術語說明)。p.214歐亞書局CH6酵素p.228圖6–25(a)歐亞書局CH6酵素p.228圖6–25(a)(續)歐亞書局CH6酵素p.228圖6–25(a)(續)歐亞書局CH6酵素p.228圖6–25(b)歐亞書局CH6酵素p.228機制圖6-25溶菌酶的機制。在此反應中(文中已解釋),水分子被加入到Mur2Ac的碳-1(C-1)但保存原有醣苷鍵的組態,因此是一種能保留原有組態之分子取代反應。(a)有兩種反應過程被提議過,這兩者都能解釋整體反應過程及特性。左邊代表SN1過程是原先Phillips所提出的機制,而右邊的SN2則是最符合現今實驗數據的機制。(b)溶菌酶表面的活性部位上的酵素-受質共價中間物以球狀-桿狀結構圖表示。活性部位殘基的側鏈則由帶狀區伸出並以球狀-桿狀結構圖表示(PDBID1H6M)。歐亞書局CH6酵素了解酵素機制促進醫學重大的進步目前各種不同的疾病,小至頭痛大至愛滋病,大部分治療的藥物都是酵素的抑制劑。其中有兩個重要的例子:抗生素藥物盤尼西林(與其衍生物),及用來治療愛滋病的蛋白酶抑制劑,它們都是不可逆性抑制劑。p.229歐亞書局CH6酵素p.230圖6–26歐亞書局CH6酵素p.230圖6-26轉胜肽酶反應。這反應靠著轉胜肽酶活性區域上的一個Ser,經由與胰凝乳蛋白酶相似的共價催化機制的幫助下,把兩個肽聚糖前驅物連結成一個較大的聚合物。注意肽聚糖是在自然環境中少數可發現D-胺基酸的地方。活性區域上的Ser會攻擊兩個D-Ala之間的胜肽鍵上的羰基,受質與酵素之間形成一個共價酯鍵,並釋放出一個尾端的D-Ala殘基。接著,第二個肽聚糖前驅物上的胺基會攻擊這酯鍵,把酵素置換掉,並使兩個前驅物連結起來。歐亞書局CH6酵素p.231圖6–27(a)歐亞書局CH6酵素p.231圖6–27(b)歐亞書局CH6酵素p.231圖6-27β-內醯胺環抗生素對轉胜肽酶的抑制作用。(a)β-內醯胺環抗生素的特色是它有一個五元的四氫噻唑環(fivememberedthiazolidinering)及一個四元β-內醯胺環。β-內醯胺環是被拉緊的並屬於醯胺基的一部分,後者在抑制肽聚糖的合生上扮演著關鍵的角色。不同的盤尼西林其取代基(R)都不一樣。第一個分離出的盤尼西林G是目前最有效的盤尼西林之一,但它會被胃酸分解,因此必須使用注射的方法。盤尼西林V則有效又能耐酸,所以可以口服使用。安蒙西林的有效性非常廣,而且可以口服,是最普遍處方用的β-內醯胺環抗生素。(b)轉胜肽酶活性區域上的Ser攻擊β-內醯胺環上的氨基部分後,會產生一個共價醯基產物。這產物的水解反應很慢(可視為不可逆),因此抑制轉胜肽酶的活性。歐亞書局CH6酵素p.229人類大量使用盤尼西林及其衍生物,導致其演化出表現β-內醯胺酶(β-lactamases)(圖6-28a)的致病性細菌株。β-內醯胺酶可以切割β-內醯胺環抗生素而使它們失活。因此,細菌會對抗生素產生抗藥性。HIV病毒後來很快就被發現並確定是一種反轉錄病毒(retrovirus)。歐亞書局CH6酵素p.231圖6–28(a)圖6-28β-內醯胺酶的作用及其如何被抑制。(a)β-內醯胺酶可以切割β-內醯胺環抗生素中的β-內醯胺環,而使它們失活。歐亞書局CH6酵素p.231圖6–28(b)圖6-28β-內醯胺酶的作用及其如何被抑制。(b)棒酸是一種自殺性失活劑,利用β-內醯胺酶正常的化學機制把一個活化物黏附在活性區域中。這活化物會被活性區域中的功能基攻擊並且不可逆地將酵素醯化。歐亞書局CH6酵素p.232圖6–29圖6-29HIV蛋白酶的作用機制。活性區域中(來自不同次單元)的兩個Asp殘基作為一般酸-鹼催化劑,幫助水分子去攻擊胜肽鍵。反應路徑中的粉紅色標示為不穩定的四面體中間產物。歐亞書局CH6酵素p.232圖6–30圖6-30HIV蛋白酶抑制劑。羥基(紅色的部分)是一個過渡狀態的類似物,模擬了四面體中間產物中的氧。而其旁邊的苯環(藍色的部分)則會幫助藥物正確地座落在活性區域的位置。歐亞書局CH6酵素總結6.4胰凝乳蛋白酶是一絲胺酸蛋白酶,其反應機制被了解最清楚,其催化反應的特徵為一般酸-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