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设计性实验小组成员：黄金汇魏青卞徐磊唐晓婧刘欣欣周伟徐振扬2008年10月生技0611第5组本实验通过用实验室自来水（对照组）、洗涤剂、新校区河道污水、一定范围内不同浓度的硫酸铜溶液处理蚕豆根尖，通过观察计数后计算蚕豆根尖细胞微核千分率得出样品溶液污染指数。摘要结果表明：七种处理液处理后的蚕豆根尖细胞的微核千分率分别为2.00‰、2.67‰、4.67‰、3.67‰,4.00‰，5.33‰，6.33‰六种样品污染指数分别为1.33，2.33，1.83，2.00，2.67，3.17。这表明学校新校区存在中度污染，应注意环境的保护。前言：随着科技的飞速发展，不断有新的化学物质和“工业三废”进入我们的生活，它们中许多都是“致畸、致癌、致突变”的物质，可以对人类健康产生巨大的威胁。微核试验(micronucleustest，MCNT)是以动植物为材料，观测材料细胞出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度从而检测遗传毒物的一种方法。在各种微核实验中，常采用蚕豆(vciafaba)根尖细胞微核法，蚕豆根尖细胞微核试验(Mircronu—cleustest，简称MCNT)技术是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试点的植物微核检测方法，此可用微核率大小来表示诱变因子的强弱。我国科学家陈光荣在I983年开始用蚕豆根尖微核技术(ViciaMCN)来检测农药和化学诱变剂对染色体的损伤情况。目前利用蚕豆初生根尖微核技术监测环境污染和危险化学品的研究已得到了广泛的应成为我国水环境监测的规范化方法之一[2]；利用蚕豆根尖细胞微核技术以下优越性：方法简便，鉴别客观，易于掌握，不需要特殊的仪器和药品，敏度高，可靠性强；而且有显而易见的实用性，且蚕豆根尖细胞周期中大部分时间处于对诱变剂敏感的间期，便于遗传毒性检测试验，精确度也比较高，现已广泛地应用于污水的检测。本实验就是利用蚕豆根尖微核检测技术对新校区河道污水水质污染，生活用品，化学用品的情况进行评价。关键词：蚕豆微核污染指数一、实验目的：☆了解细胞微核形成的机理及其形态特点☆学习植物根尖细胞的微核测试技术☆进行小组合作，掌握设计实验基本能力正文:实验设计，实验过程等二、实验原理：微核是真核细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核外，大小应在主核1/3以下，微核测试是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试点的微核检测方法，用微核率大小表示诱变因子强弱，经证实微核率大小和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关。三、实验材料：蚕豆实验用具和药品：●显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸、电子天平、试管、镊子、广口瓶、脱脂棉等；●无水乙醇、冰醋酸、改良石炭酸品红染液、HCl等；●洗涤剂，新校区河道污水、硫酸铜。四、实验过程：1.浸种催芽（10月1日-6日）选择无虫、饱满、大小均匀的蚕豆种子40粒放入盛有自来水的培养皿中，25℃浸泡24h,其中换水2次。种子吸胀后，在培养皿中铺一层脱脂棉，倒入少量自来水，将种子置于其中培养5天，大部分初生根长至1～2cm左右。2.处理液的配置◇对照组自来水直接由实验室取得；◇配制12.5mg/L,25mg/L,50mg/L,100mg/L四种浓度的硫酸铜溶液；◇取洗涤剂稀释5倍备用；◇取新校区河道污水稀释5倍备用。四、实验过程：3.处理（10月7日12：30-16：30）用上述七种处理液处理根尖，每一处理选取4-5粒初生根良好、根长较一致的种子，置于盛有被检测液的培养皿中，被测液浸没根尖即可，贴上标签，处理4h。4.根尖细胞恢复培养（10月7日17：00-10月8日16：00）处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2～3分钟。洗净后置于铺有脱脂棉的培养皿中，加自来水于25℃恒温箱中恢复培养23h。5.根尖细胞固定（10月8日16：30-10月9日13：30）将恢复培养后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入广口瓶中，以无水乙醇：冰醋酸=3：1的比例配制卡诺氏固定液，倒入广口瓶进行固定21h。四、实验过程：6.解离、染色、压片用蒸馏水浸洗固定好的幼根两三次，每次3分钟，吸去蒸馏水，加入1mol/L盐酸将幼根浸没，于60℃水浴解离20分钟，幼根软化即可。然后吸去盐酸，用蒸馏水浸没清洗幼根三次，每次1～2分钟。在凹面玻片内滴加改良石炭酸品红染液，染色10分钟，制片前取出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴改良石炭酸品红染液，加上盖玻片，覆一层吸水纸，用解剖针或镊子垂直敲打，然后以拇指垂直紧压盖片（注意勿使盖片搓动），使材料分散压平，便于观察。7.镜检观察计数在常规制片后，将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察，找到分生组织区细胞分散良好、核膨大、分裂相对较多的部分转到高倍镜下进行观察。在显微镜下观察微核个数，数900～1000个蚕豆根尖细胞，记下含有微核的个数，计算出各个处理的蚕豆根尖微核千分率（MCN‰）并与自来水对照组相比得出污染指数（PI）。五、数据分析方法：根据观测结果，计算各处理下微核的千分率，并根据下述算式计算各处理的微核率污染指数：◆微核率（MCN‰）=测试样品（或对照）观察到的微核个数/测试样品（或对照）观察细胞总数×1000‰◆污染指数（PI）=样品微核千分率平均值/对照水样微核千分率平均值污染指数在0～1.5区间，基本没有污染，在1.5～2区间,为轻度污染,在2～3.5区间为中度污染，在3.5以上为重度污染。六、结果与分析：1.实验结果各检测样本引起的蚕豆根尖细胞微核率的镜检结果记载表组别被检测液1000个间期细胞中微核数微核率（MCN‰）污染指数（PI）1自来水（对照组）0，3，32.00‰——2洗涤剂稀释液3，3，22.67‰1.333新校区河道污水稀释液5，6，34.67‰2.33412.5mg/L硫酸铜2，5，43.67‰1.83525.0mg/L硫酸铜1，6，54.00‰2.00650.0mg/L硫酸铜5，4，75.33‰2.677100.0mg/L硫酸铜4，8，76.33‰3.17六、结果与分析：从表中可以看出：▲新校区河道污水在稀释了5倍后为中度污染，▲100.0mg/L的硫酸铜溶液污染指数最大，表明其对供试材料有较强烈的致畸作用。▲污染程度新校区河道污水洗涤剂自来水▲通过本实验对不同浓度硫酸铜溶液微核率的检测可推断硫酸铜浓度在0-100mg/L间微核率与溶液浓度呈正相关。六、结果与分析：2.分析讨论误差分析：处理时间较短，仅4小时，检测的微核率较小；镜检时，由于细胞数量较多，视野较小，在数数上也存在一定误差。选材：由于蚕豆易于培养，对诱变物质敏感等优点，所以选择蚕豆为本次实验材料。选择洗涤剂是因为想了解日常用品的污染指数、对我们皮肤等的伤害，由于蚕豆数量有限，放弃了对洗衣粉，消毒液等的检测而选择了洗涤剂作为代表。另外，我们还想了解重金属离子对蚕豆根尖的毒害作用，但担心浓度过高会杀死根尖，因此配制0-100mg/L的四个浓度梯度的硫酸铜溶液进行实验。这样可以在横向核纵向上对蚕豆实验以得出较好的结果。污染问题：通过本次实验，我们发现洗涤剂在稀释了5倍后基本没有污染，平时使用中稀释倍数更大，因而安全性较好，而新校区河道污水在稀释了5倍后为中度污染，可以认为未稀释的水污染比较严重，经过分析讨论认为主要是新校区的建设还未完成，施工对河道产生污染，此外还有宿舍楼的生活污水也对其有危害。六、结果与分析：3.思考与建议在实验过程中我们想到用孔板法培养蚕豆，但由于实验器材的限制，我们在培养中将脱脂棉抠了几个洞便于培养以代替孔板的效果；考虑到用被测液处理蚕豆根尖的时间长短可能会影响微核率，但由于材料数量的限制等因素没有去实践，建议以后实验中把它加入；用蚕豆实验测试河道污水准确度不大，存在一定的缺点，因而要准确掌握污染源的污染程度，应用生物毒性测试与理化监测相结合，以便有效地采用相应措施保护水资源。六、结果与分析：结语：蚕豆根尖微核试验是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试终点的植物微核检测方法，是世界范围内推广运用的环境致突变性检测技术。它具有许多其它方法无法比拟的优点，比如蚕豆根尖微核技术在遗传毒理检测中具有良好的剂量效应和较宽的检测物谱，以蚕豆为试验材料成本很低，仪器较简单，不伤害操作工作人员的健康，比较适合县市级下的地方环境监测部门使用。六、结果与分析：参考文献[1]陈瑞娇;李均祥.蚕豆根尖微核试验在环境致突变物检测中的应用[J].韶关学院学报.2006/27/9:87～90.[2]王樊彦.蚕豆根尖细胞馓棱技术现状[j]，环境科学，1988．10(4)：66～70[3]王英彦,汤大友.蚕豆根尖细胞微核检测技术的污染指示性与其他指标的比较[J].中国环境科学,1987,7(5):45-50.[4]段昌群等重金属对蚕豆的细胞遗传学毒理作用和对蚕豆根尖微核技术的探讨[J]．植物学报，1995．37(1)：14～24[5]王英彦,汤大友.15种化学物质的蚕豆根尖细胞微核效应[J].中国环境科上升学,1986,6(2):19-23.