诱导多能干细胞

诱导多能干细胞(IPS)InducedpluripotentstemcellIPS细胞的定义通过一定的途径将与细胞多能性有关的基因导入到已分化的体细胞中，或者同时添加一些辅助作用的小分子化合物使体细胞去分化重编程回到胚胎干细胞状态，所获得的细胞即为IPS细胞。IPS细胞与胚胎干细胞（ES）形态相似、核型、端粒酶活性、体外分化潜能均相同，同时也能够表达相同的表面标志分子。诱导多功能干细胞技术的理论及基础体细胞重编程现象：从Briggs和King通过核移植的方法获得来自囊胚的克隆蝌蚪到克隆羊“多莉”的诞生为已经分化了的细胞能够去分化和重新编程提供大量证据。诱导多功能干细胞技术的理论及基础多能干细胞的特异调控网：Oct4,Sox2和Nanog等构成调控网，通过对下游基因的激活及抑制在维持ES细胞的多能性和自我更新中发挥作用。小鼠和人诱导多功能干细胞技术的诞生1.小鼠IPS细胞的诞生:2006年Yamananka研究组用Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4四个转录因子诱导MEFS重编程至多功能干细胞状态。2.人的IPS细胞诞生:Yamanaka实验组将转录因子Oct4,Sox2,Klf4及c-Myc以逆转录病毒为载体诱导人类表皮细胞及结缔组织细胞重编程为IPS细胞。iPS细胞诱导机制已分化的细胞导入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆转录胚胎干细胞培养条件和筛选Ips细胞构建IPS细胞示意图转录因子Oct4:Oct4能够促使ICM的形成，维持ES细胞未分化状态并促使其增值，是细胞全能性的标志基因之一。转录因子Sox2:Sox2通常与Oct4结合形成Oct4/Sox2蛋白复合体调控FGF4，UTF1等因子来维持ES细胞的全能性。转录因子C-Myc:c-Myc是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因，它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES细胞的分化。转录因子Klf4:Klf4上皮锌指转录因子Klf4(旧称GKLF)调节体外细胞的增生与分化.转录因子Nanog:对促分化基因的抑制方面发挥作用。其他的转录因子Lin28,SV40LargeTantigen,UTFI等等IPS过程中转录因子的协同作用在维持ES细胞特性相关的转录因子及染色质调控相关的基因都受到Oct4,Sox2,Nanog和其他多能相关因子的调控，并且这些调控因子即能相互调控又能调控自身的表达，这样就组成了一个复杂的调控网络。IPS技术的关键因素1.获得初始的体细胞为重编程靶细胞2.构建诱导重编程因子的载体3.携重编程因子的载体作用于体细胞4.IPS细胞的获得，鉴定及培养体系的建立诱导IPS细胞的实验流程靶细胞的选择1.靶细胞类型影响重编程效率2.靶细胞类型影响嵌合鼠的成瘤率载体的选择病毒慢病毒，逆转录病毒：共同缺陷1.病毒的随机插入及病毒表达不可调控2。病毒如果不能沉默就会导致外源基因的持续表达3.病毒的重新激活会导致肿瘤相关基因c-Mycj及Klf4的重新表达。可诱导病毒表达系统：这个系统无法避免病毒对宿主细胞基因组的随机组合多顺反子及剪切体系：减少病毒的插入位点，保障所有转录因子在同一受染细胞内的同时表达，且表达量可以实现一定的平衡。Cre-LoxP重组剪切系统：实现对外源基因表达的调控及切除外源的原癌基因腺病毒：避免病毒载体插入宿主细胞基因组可能引起的基因突变等后果。但是编程效率低。载体的选择质粒普通质粒载体：需要反复多次的质粒转染来实现质粒携带基因的持续表达，效率比逆转录病毒载体低。转座子：能够携带较的整合片段，可以通过转座子酶切除转座子携带的外源基因。附着体：提高重编程效率，可以获得不含质粒的宿主细胞。介导IPS的参与因素蛋白质：安全性高，穿越细胞膜的能力有限。小分子化合物：有可能带来细胞毒性和无法检测得微小变化microRNA:替代了原癌基因，提高了编程效率IPSIPS细胞的筛选方法a.形态学筛选不对供体细胞做任何额外遗传修饰的情况下，仅依靠形态学筛选的标准对细胞进行筛选也能够分离出IPS细胞。b.药物筛选利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的体细胞，并用特定药物进行筛选。c.选用对多能性更为关键的基因（如Fbx25）作为报告基因原理是Fbx25对于多能性的维持和胚胎的发育来说是不可缺少的基因IPS细胞的鉴定表观遗传状态鉴定:IPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲基化模式和组蛋白修饰情况。IPS细胞中的多能基因，如oct-4，Nanong等的启动子区域CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低甲基化状态。IPS细胞的多能基因启动子区域具有与ES细胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3水平。IPS细胞的鉴定基因表达模式和发育潜能鉴定ES和IPS细胞基因表达谱基本相同。IPS细胞具有发育为三个胚层的能力，并能参与生殖系的发育，这与ES细胞相同。IPS细胞的鉴定表面标志分子鉴定:IPS细胞能够表达多能干细胞特异的表面标志分子，如：ssea-1（阶段特异性胚胎抗原1），ssea-3等。这些物质在已分化体细胞表面不表达，从而鉴定。IPS细胞的鉴定基因表达模式和发育潜能鉴定ES和IPS细胞基因表达谱基本相同。IPS细胞具有发育为三个胚层的能力，并能参与生殖系的发育，这与ES细胞相同。信号通路信号通路TGF-P信号通路MEK和GSK3信号通路Wnt信号通路是维持人类ES细胞多能性的主要信号通路。MEK信号通路：促进肝细胞分化。GSK3信号通路：抑制细胞增值。提高无c-Myc参与的OSK介导的IPS的效率。IPS技术的应用及其意义1.基于IPS细胞的细胞移植治疗2.人类疾病模型，病人特异的疾病及药物筛选3.重编程机理解析4.新物种的多能肝细胞基于IPS细胞的细胞移植治疗人类IPS细胞走向临床应用面临着免疫排斥的困难，而IPS技术有望解决这一难题。人类疾病模型，病人特异的疾病及药物筛选IPS最大的特点是“患者特异性”及“疾病特异性”，基于这两点。IPS细胞可以重现患者的疾病发生，发展过程，可作为人类疾病发生发展的机理，并筛选出患者特异的有效药物，最终找到疾病治疗的切入点。IPS细胞在疾病研究中的作用重编程机理解析以IPS技术为基础，筛选在体细胞重编程过程中起关键作用的基因，蛋白和小分子化合物，并利用这些物质相关的信号通路及上下游相关因子揭示重编程的机理，为建立体细胞重编程的新技术新方法，研究体细胞去分化的机制开辟新思路。新物种的多能肝细胞目前许多物种ES细胞系的缺乏阻碍了转基因动物模型的建立，IPS技术的诞生开拓了制造多能干细胞系的新途径。2012年诺贝尔生理学或医学奖发现成熟细胞可以被重新编程为多功能的干细胞（即诱导多功能干细胞）JohnB.Gurdon约翰・格登ShinyaYamanaka山中伸弥