3 第十六章 色谱法概论

仪器分析黄红霞第16章色谱分析法概论AnIntroductiontoChromatography1授讲人：黄红霞办公室：理工1号楼319室Tel:[phone]Mail:[e-mail]仪器分析黄红霞ShowTime2俄国植物学家Tsweet色谱法是一种能够把不同颜色混合物中的颜色分离出来的方法仪器分析黄红霞内容3发展概况色谱法及分类分离机制色谱理论仪器分析黄红霞§1色谱法发展概况一、色谱法历史Before1930s：色素的分离色谱法(Chromatography）创始于20世纪初，俄国植物学家Tsweet用于植物色素的分离。石油醚—流动相(mobilephase，eluant,eluent)CaCO3颗粒—固定相（stationaryphase）相对运动Chromatography又称“层析法”洗脱液色素色带洗脱液,废水4仪器分析黄红霞1940s:薄层色谱(TLC)和纸色谱法5纸色谱法染料颜色甜品罐装蔬菜食物RNA指纹仪器分析黄红霞1950s:James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气相色谱法(GC)，获得诺贝尔化学奖——色谱法从单一的分离功能到分离分析功能以岛津GC为例61956年，第一台GC-1A2004年，GC-201450年35个型号仪器分析黄红霞1960s:高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱法（HPLC）1980s:Jorgenson等集前人经验发展起来的毛细管电泳(CE)7仪器分析黄红霞优点：“三高”、“一快”、“一广”局限性：高选择性高效能:分析效率高高灵敏度:10-11-10-13g，适合痕量分析分析速度快:1-10分钟分析时间应用范围广:气体、液体、固体样品二、色谱法特点定性、定结构的特异性低，需要与其它的分析方法相结合（如GC-AAS，LC-MS）8分离和分析仪器分析黄红霞三、色谱法现状和发展趋势9HPLC-MSGC-IR增强自动化，建立各种联用技术,用于复杂样品的分析，如中药分析或代谢组学新型固定相和检测器，如UPLC，ELSD检测器，电雾式检测器和荧光检测器等仪器分析黄红霞10石油陆婉珍院士中山大学酶填充农药、食品和药物安全功能化材料极端条件（航空航天，深海）大连化物所卢佩章院士张玉奎院士南开大学纳米材料仪器分析黄红霞一、色谱法定义是一种物理化学分析方法，利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。固定相固体液体流动相液体气体11§2色谱法及分类仪器分析黄红霞二、分类平面色谱法纸色谱薄层色谱（TLC）高分子薄膜色谱柱色谱法填充柱色谱毛细管柱色谱开管柱色谱1、操作形式*柱色谱法:固定相装于柱管内,流动相在压力或重力作用下流动*平面色谱法：固定相构成平面状层,流动相在毛细管或重力作用下流动12仪器分析黄红霞2.分离机制(1)吸附色谱:被分离组分对固定相表面吸附中心的吸附能力(2)分配色谱:在固定相和流动相两相之间的分配系数差别(3)离子交换色谱:被分离组分离子交换能力(4)分子排阻色谱:被分离组分分子的线团尺寸或渗透系数大小13仪器分析黄红霞3.两相分子聚集状态类型I流动相固定相类型II液相色谱(LC)液体固定液固色谱法(LSC)液体液体液液色谱法(LLC)气相色谱(GC)气体固定气固色谱法(GSC)气体液体气液色谱法(GLC)超临界流体色谱法（SFC）超临界流体固体14仪器分析黄红霞4.系统分类Chromatogr.GCLCSupercriticalfluidchromatography(SFC)opentubularcolumnchromatographypackedcolumnchromatographycolumnchromatographyplanarchromatographycounter-currentchromatographyClassicLCHPLCTLCPC15仪器分析黄红霞色谱的分离过程如吸收色谱，组分在两相中的平衡过程：吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复洗脱→不同的分配系数→迁移率差→分离♫☞16四、基本术语仪器分析黄红霞1.色谱图：检测器输出的信号强度对洗脱时间作图所绘制的曲线2.色谱峰：组分流经检测器所产生的信号（一）色谱和色谱峰173.基线（baseline）:在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线.稳定的基线应是一条平稳直线，反映仪器的噪声随时间的变化基线漂移仪器分析黄红霞4.峰形参数：对称因子（fs）fs0.95,前延峰fs1.05，拖尾峰fs为0.95-1.05称为对称峰18W0.05h为0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽色谱峰三种形式：ABAAWfhs2/)(2/05.0仪器分析黄红霞（二）保留值191.保留时间（tR）：进样开始到某组分的色谱峰定点的时间间隔死时间（t0或tm)：不被固定相吸附或溶解的组分(k=0）的保留时间。根据t0可求流动相平均流速0tLu仪器分析黄红霞2.保留体积,VR:对称峰，组分1/2量被洗脱出色谱柱时消耗的流动相体积。与流动相流速无关死体积,V0:柱中固定相颗粒间间隙的容积cFtV00调整保留体积,：保留体积扣除死体积后的体积'RVcRRRFtVVV'0''Rt调整保留时间，:组分在固定相中滞留的时间，是定性的基本条件20流速0R'Rttt＝cRRFtV注意：VR’是定值，tR’与FC成反比仪器分析黄红霞3.相对保留值,r:两组分的调整保留值之比,也称分离因子，是色谱系统的分离选择性指标'1'2'1'21,2RRRRVVttr4.保留指数,I:Kovats指数，气相色谱中的定性参数注意：r与固定相和柱温相关，与柱径、柱长、流动相流速等无关')(')(')(')(lglglglg100ZRnZRZRxRxttttnZI21z与z+n为正构烷烃对的碳原子数，Z为6，7，8，I为600，700，800仪器分析黄红霞（三）色谱峰高,h和峰面积,A（定量分析指标）（四）色谱峰区域宽度★衡量柱效的重要参数之一三种方法：1.标准差(standarddeviation;σ)：0.607倍峰高处的峰宽之半/半峰宽2.半峰宽（W1/2）：W1/2=2.355σ3.峰宽(peakwidth;W):W=4σ=1.699W1/2★区域宽度越小柱效越高22仪器分析黄红霞（五）分离度(resolution，R)又称分辨率，是总分离效能指标，能真实反映组分在色谱柱中的分离情况相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比21122112)(2)(21WWttWWttRRRRR23仪器分析黄红霞◆当R=1.5，两峰完全分开(99.7%)，又称基线分离.◆R≥1.5药物定量分析要求（中国药典2010版规定）.24仪器分析黄红霞四、分配系数和色谱分离25(一)分配系数和保留因子分配系数msVVKk（二）分配系数和保留因子与保留时间关系两者关系ms=CCK保留因子k=msmmRttR0'uvR'v=L/tRçu=L/t0ssmmmmSmmsmm'VCVCVCNNNtttRkR11'RttR0'tR=t0(1+k)tR=t0(1+K)msVV0'R00Rtttttk仪器分析黄红霞注意：保留因子表示组分在色谱柱中多停留的时间与死体积的比值26K↑，tR↑K=0，组分无保留K→∞，组分保留时间长仪器分析黄红霞（三）色谱分离的前提27KA≠KB或kA≠kB是色谱分离的前提。推导过程：=t0(1+KA)ARtBRt=t0(1+KB)tR=t0(KA－KB)msVVtR≠0KA≠KBkA≠kB仪器分析黄红霞色谱图的意义：色谱峰数＝样品中单组分的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。α和k是计算分离效能的重要参数！28仪器分析黄红霞（一）吸附色谱（二）分配色谱（三）离子交换色谱（四）分子排阻色谱29§3分离机制仪器分析黄红霞（一）吸附色谱固定相→吸附剂（硅胶orAl2O3）吸附活性中心机制：见图组分分子与流动相分子争夺吸附中心吸附系数30吸附平衡Xm+nYa→Xa+nYmNote：Ka与组分的性质，活性剂的活性和流动相性质有关)1(0maaRVSKtt柱色谱中namnmaa]][Y[X]][Y[X=Kmmaamaa//][X][XVXSXK仪器分析黄红霞吸附色谱法固定相多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等仪器分析黄红霞吸附色谱法流动相有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。仪器分析黄红霞一些溶剂在硅胶上的o值溶剂溶剂强度（o）溶剂溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70仪器分析黄红霞洗脱顺序ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。吸附色谱法仪器分析黄红霞（二）分配色谱固定相:涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体流动相:气体或液体机制：见图与萃取类似分配系数35Note：Ka与流动相性质，固定相极性和柱温有关mmssmsVXVXCCK＝仪器分析黄红霞分配色谱法固定相又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。仪器分析黄红霞分配色谱法洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。仪器分析黄红霞（三）离子交换色谱固定相：离子交换树脂和化学键合离子交换流动相:缓冲溶液分析:离子化合物(有机或无机离子)机制见图离子交换能力差异38阳离子交换树脂RSO3-H++X+→RSO3-X++H+不可交换离子可交换离子决定离子阴离子交换树脂RNR3+OH-+X-→NR3+X-+OH-仪器分析黄红霞39选择性系数与分配系数关系++RBARAB离子交换通式BAA/B]B/[]BR[]A/[]AR[KKK－－KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，KA/B越大，A的交换能力大，越易保留。常选择某种离子（如H+或Cl－）作参考。KA、KB为A、B的分配系数。仪器分析黄红霞离子交换色谱法固定相离子交换树脂:有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基(－SO3H)、羧基(－COOH)及季胺基(－NR3+OH－)等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。化学键合离子交换剂：键合在薄壳型和全多孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相流动相一定pH和离子强度的缓冲溶液，有时也加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高选择性。仪器分析黄红霞离子交换色谱法影响保留行为的因素被分离离子、离子交换剂、流动相的性质等(1)离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径,选择性系数小。(2)离子交换剂的交联度和交换容量:一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越