木本植物的遗传转化4.7

实验三木本植物的遗传转化农杆菌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导法含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。根癌农杆菌（Ti质粒）Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，Ti质粒具有五个主要功能区域，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeats)，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。,实验目的掌握遗传转化的原理和操作技术。初步掌握农杆菌介导转化植物的方法。农杆菌介导法原理Ti(tumorinducing)质粒是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)所特有的质粒，是天然的基因载体，可高效整合到植物细胞的基因组中。农杆菌Ti质粒中心T-DNA在毒性区Vir基因的作用下，转入植物细胞，并插入植物基因组中共同复制与表达。材料、设备及试剂材料：叶片设备及试剂：超净工作台、离心机、振荡培养箱、试剂瓶、培养皿、酒精灯等。Kan、利福平(rif)、YEB、乙醇等。（1）工程菌液的制备（2）外植体消毒将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠中10min，用无菌水洗3次，每次1-2min。（3）预培养以叶片作受体材料，选择完全展开、深绿色的叶片，横过叶片的主脉剪2-3下，放到诱导分化培养基上进行预培养3d。（4）、侵染在超净工作台上，将工程菌液倒入无菌三角瓶中，将预培养的叶片浸入工程菌液中，5min.（5）共培养取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液，将叶片放入新的培养基中，共培养。（提前倒平板）（6）脱菌与选择培养暗培养结束后的叶片，在超净工作台中转入含有头孢唑啉钠的培养基中，进行除菌。一周后进行选择培养。（7）诱导芽生长、生根，形成转化植株实验步骤：步骤：农杆菌的活化（1）工程菌液的制备挑单克隆测OD600=0.5收集细胞用液体LB培养基重悬细胞稀释20-50倍2、外植体消毒将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠中10min，用无菌水洗3次，每次1-2min3、预培养以叶片作受体材料，选择完全展开、深绿色的叶片，横过叶片的主脉剪2-3下（如图1），放到诱导分化培养基上进行预培养，预培养时间分为3d。图1用于预培养的叶片右：用于转化；左：不宜作转化外植体体左，4、侵染在超净工作台上，将工程菌液倒入无菌三角瓶中，将预培养的叶片浸入工程菌液中，浸泡为5min.5、共培养取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液，将叶片放入新的培养基中，共培养。（提前倒平板）在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽6、脱菌与选择培养暗培养结束后的叶片，在超净工作台中转入含有头孢唑啉钠的培养基中，进行除菌。一周后进行选择培养。诱导芽生长、生根，形成转化植株Ⅲ-2选择生根培养（Kan15mg/L）左，转化植株；右，非转化植株Ⅲ-4非转化植株的生根左，不含卡那霉素；右，卡那霉素浓度15mg/L实验报告简述植物遗传转化的过程共培养时需要注意哪些问题？