16 Southern杂交技术

第16讲核酸分子杂交------Southern杂交基本内容一、核酸分子杂交技术二、Southern杂交的原理三、Southern杂交的主要步骤四、Southern杂交的应用五、课堂小结六、作业一、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的基本技术之一。1、基本原理：具有一定序列同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补配对原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。杂交的双方是待测核酸序列及探针。将核酸从细胞分离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。一、核酸分子杂交技术2、核酸分子杂交的分类：①液相杂交：将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难，误差较高。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。一、核酸分子杂交技术2、核酸分子杂交的分类：②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。固相杂交时，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。滤膜（固相）杂交一、核酸分子杂交技术2、核酸分子杂交的分类：③膜杂交：用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。一、核酸分子杂交技术2、核酸分子杂交的分类：④原位杂交：菌落原位杂交；组织原位杂交；染色体原位杂交等。一、核酸分子杂交技术2、核酸分子杂交的分类：⑤生物芯片：高通量，高效的最新生物技术。3、核酸杂交过程：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。一、核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术3、核酸杂交过程：4、影响因素*离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交)*温度（低于Tm20-25℃）*有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm*样品/探针分子的大小和复杂程度*洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针）*支持物*添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）一、核酸分子杂交技术二、Southern杂交的基本原理•Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定DNA分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即核酸分子杂交过程。•该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。•早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。二、Southern杂交的基本原理•利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。二、Southern杂交的基本原理三、Southern杂交的主要步骤1、待测DNA样品的制备、酶切2、待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3、凝胶中DNA的变性：碱变性4、Southern转膜：–硝酸纤维素膜(NC)、尼龙膜–毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法三、Southern杂交的主要步骤4、Southern转膜：三、Southern杂交的主要步骤4、Southern转膜：三、Southern杂交的主要步骤4、Southern转膜：5、探针的制备①探针的选择原则高度的特异性制备探针的难易性检测手段的灵敏法三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备②探针设计原则•长度：10~50bp•碱基成分:G+C含量为40%~60%•探针分子内无互补序列。•避免同一碱基重复出现。•一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备③探针的种类cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备④放射性探针标记物[α-*N]-dNTP、32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)、14C、131I特性：检测特异性强；灵敏度高；对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；易造成放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。三、Southern杂交的主要步骤三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备5、探针的制备⑤非放射性标记•优点：无环境污染，可较长时间贮存•要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备⑤非放射性标记分类：–半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。–配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗生物素蛋白(streptavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。–荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。–化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以像放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后研究的主流。–光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在光镜下或电镜下进行观察。三、Southern杂交的主要步骤5、探针的制备⑥探针标记–随机引物法–缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)–末端标记法•碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP标记DNA/RNA-5′•末端转移酶（poly(N*)n）•T4DNA聚合酶/Klenow片断（粘末端补平）三、Southern杂交的主要步骤6、预杂交封闭：非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。常用封闭物：•①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA•②高分子化合物：脱脂奶粉三、Southern杂交的主要步骤三、Southern杂交的主要步骤7、杂交★杂交炉内杂交★洗膜三、Southern杂交的主要步骤8、杂交结果的检测①放射自显影利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，显出影像后进行放射性标记物的定位和定量测量的技术称为放射自显影。8、杂交结果的检测①放射自显影其基本步骤是：–用放射性墨水在滤膜上一定部位进行标记，以利于以后的定位。因为滤膜的放射性本底一般可使X光片上将滤膜清晰地显示出来，此步骤一般可以省略。–将滤膜用保鲜膜包好，置暗盒中。在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光面向上。再压一至两张X光片，再压上增感屏后屏，光面向X光片。盖上暗盒，置-70℃曝光适当的时间。–根据放射性的强度曝光一定的时间后，在暗室中取出X光片，显影，定影。如曝光不足，可再压片重新曝光。三、Southern杂交的主要步骤8、杂交结果的检测②非放射性核素探针的检测除酶直接标记的探针外，其它非放射性标记物并不能被直接检测，而需经两步反应将非放射性标记物与检测系统偶联。第一步称为偶联反应，第二步称为显色反应。•偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。三、Southern杂交的主要步骤8、杂交结果的检测②非放射性核素探针的检测显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类：–酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。–荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。–化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。–电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检测。主要适合于细胞原位杂交检测。三、Southern杂交的主要步骤SouthernBlotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测）5.结果检测–DNA指纹分析四、Southern杂交的应用在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定3、癌基因点突变分析4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定四、Southern杂交的应用五、课堂小结六、作业：Southern杂交的原理和主要步骤O(∩_∩)O谢谢