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王玮1、糖组学(glycomics)的背景及研究意义20世纪末,继基因组学、蛋白质组学之后,糖组学也日益受到人们关注。顾名思义,糖组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科,是基因组学的后续和延伸,具体内容包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞,不仅体现细胞的类型和状态,也参与了许多生物学行为,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、免疫反应等;聚糖还体现生物和分子的进化作用,如糖酵解、生物合成的保守性以及核糖的起源等。糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性免疫球蛋白如缺乏N-糖链则不能分泌到胞外而留在内质网中血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的N-糖链糖蛋白，称唾液酸糖蛋白，如免疫球蛋白、蛋白质激素，载体蛋白等。如被唾液酸酶降解与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合胞吞作用并降解●与血浆中老蛋白的清除有关●与细胞粘着有关细胞粘着(celladhesion)是进化中随着多细胞生物出现的必然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力——细胞粘着。细胞群或组织(tissue)中细胞与细胞之间充满着由糖蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白)、蛋白聚糖、透明质酸等组成的胞外基质(extracellularmatrix,ECM)。在整个生物体中,ECM形成一个连续的主体网络结构,所有的细胞都交织或浸泡在这一网状基质中,网络中细胞一细胞粘着,细胞一ECM粘着都是通过有关的膜内在蛋白质(integralmembraneprotein)完成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子(celladhesionmolecule,CAM)或粘着蛋白,包括整联蛋白(integrin),钙粘着蛋白(cadher--in)免疫球蛋白超家族(Igsuperfamily),血管地址素(vescularaddressin)选择蛋白(selectin)等。CAM绝大多数都是含N一糖链的糖蛋白.例如整联蛋白是由α一和β一亚基组成的异二聚体,两个亚基上有多个N一糖基化位点。去糖链的整联蛋白完全失去与纤连蛋白的粘着能力。●与精卵识别有关受精是精子与卵子的融合。哺乳动物的卵子外面有一层透明的糖蛋白外衣，称透明带（zonepellucida,ZP)。透明带由ZP-1、ZP-2和ZP-3三种糖蛋白组成,受精中起主要作用的是ZP-3,连接在ZP-3上的O-GalNAc糖链能被精子表面上的凝集素受体识别(有物种特异性)。O-GalNAc糖链的非还原端是一个α一连接的半乳糖残基,它可能在精卵识别中起关键作用。●糖链与酶活性糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响,如UDP-葡糖醛酸酶、酵母羧肽酶等。有些酶的活力依赖其糖链的存在，如溶酶体β一葡糖苷酶除去糖链后只有免疫活性而而完全没有酶活力。●糖链与激素活性糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激素),LH(促黄体生成激素)和TSH(促甲状腺激素)以及胎盘绒毛膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。FSH、LH和TSH均由α亚基和β亚基组成,两个亚基都有N一糖链。糖链呈高度不均一性,例如LH和TSH中精链的外链末端有些为SO4--4GalNAcβ1，有些为Siaα2→3Galβ1→,而FSH中的糖链都是以Siaα2→3Galβ1→为末端的。已经证明，带有SO4--4GalNAcβ1→末端结构的激素对受体的亲和力比带有Siaα2→3Galβ1→末端的激素高，但在体内的半寿期前者比后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4--4GalNAcβ1→为末端的糖链的受体,而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸酶水解除去Sia从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并清除。●糖链与IgG活性每分子IgG均含糖链约三条，几乎全部N一糖链都是复杂型,非还原末端残基为Sia或Gal(去Sia),少数为GlcNAc(去Sia-Gal),IgG的N-糖链多达30余种,呈高度不均一性。如IgG的N一糖链缺失外链Gal(这种糖链称G0糖链）后,可成为一种自身抗原,被免疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有Go糖链的IgG生成免疫复合体，沉积于关节腔内,引起炎症。这种免疫复合体是由带Go糖链的IgGFc段(作为抗原)和带末端Sia的IgG(作为抗体)Fab段结合而成,实际上是IgG的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑狼疮等都是一种与IgG的糖链结构改变有关的自身免疫病(autoimmunedisease)。类风湿关节炎糖类单糖多糖糖复合物(glycoconjugates)糖蛋白(glycoprotein)蛋白聚糖(proteoglycan)糖脂(glycolipids)糖蛋白Glycoprotein第一节一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋白质。蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。分布细胞膜、溶酶体、细胞外液糖蛋白葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)岩藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神经氨酸(NeuAc)（一）糖蛋白聚糖分为N-连接和O-连接型两种一、糖蛋白糖链的结构聚糖中单糖的种类：糖蛋白糖链的N-连接型和O-连接型连接方式N-连接：O-连接：（二）N-连接糖蛋白的糖基化位点为Asn-X-Ser/Thr糖蛋白的糖链与蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天氡酰胺氮以共价键连接称N-连接糖蛋白。定义：N-连接糖蛋白中Asn-X-Ser/Thr三个氨基酸残基的序列子称为糖基化位点。（三）N-连接聚糖可分为3型①高甘露糖型②复杂性③杂合型都有一个五糖核心ManManManGlcNAcGlcNAcAsn（四）N-连接寡糖的合成是以长萜醇作为聚糖载体N-连接寡糖是在内质网上以长萜醇作为糖链载体，先合成含14糖基的寡糖链，然后转移至肽链的糖基化位点上，进一步在内质网和高尔基体进行加工而成。每一步加工都由特异的糖基转移酶或糖苷酶催化完成，糖基必须活化为UDP或UDP的衍生物。长萜醇-P-P聚糖的合成N-聚糖的加工过程（五）O-连接糖蛋白糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相连，称为O-连接糖蛋白。O-连接寡糖有N-乙酰半乳糖与半乳糖构成核心二糖，核心二糖可重复延长及分支，再接上岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺等单糖。定义O-连接寡糖结构O-连接寡糖在N-乙酰半乳糖基转移酶的作用下，在多肽链的丝/苏氨酸的羟基上连接上N-乙酰半乳基，然后逐个加上糖基直至O-连接寡糖链的形成。O-连接寡糖合成二、糖蛋白分子中聚糖的功能保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期；蛋白质的聚糖也可起屏障作用，影响糖蛋白的作用；聚糖还可以避免蛋白质中抗原决定簇被免疫系统识别而产生抗体。（一）聚糖可影响糖蛋白生物活性（二）糖蛋白聚糖加工可参与新生肽链折叠参与新生肽链的折叠并维持蛋白质的正确的空间构象；糖蛋白的糖基化与肽链的折叠及分拣密切相关。（三）糖蛋白聚糖可参与维系亚基聚合具有功能的糖蛋白的二聚体，往往依靠糖-蛋白或糖-糖相互作用维系亚基的聚合和构象。（四）聚糖对蛋白质在细胞内的分拣、投送和分泌中的作用有些蛋白质的投送信号存在于肽链内，但有些是与其糖链有关。（五）糖蛋白聚糖具有分子间的识别作用聚糖中单糖分子连接的多样性是聚糖起到分子识别作用的基础。受体与配体识别和结合也需聚糖的参与。细胞表面糖复合物的聚糖还能介导细胞-细胞的结合。蛋白聚糖Proteoglycan第二节蛋白聚糖是一条或多条糖胺聚糖以共价键与核心蛋白形成的大分子糖复合物化合物。糖占比例大，约一半以上，具有多糖性质。分布于软骨、结缔组织、角膜基质、关节滑液、粘液、眼玻璃体等组织。蛋白聚糖的结构组成核心蛋白糖胺聚糖糖胺糖醛酸葡萄糖胺半乳糖胺葡萄糖醛酸艾杜糖醛酸一、糖胺聚糖是含已糖醛酸和已糖胺组成的重复二糖单位糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）曾称为粘多糖、氨基多糖和酸性多糖等。•硫酸软骨素类(chordroitinsulfates)•硫酸皮肤素(dermatansulfate)•硫酸角质素(keratansulfate)•透明质酸(hyaluronicacid)•肝素(heparin)和硫酸类肝素(heparansulfate)体内重要的糖胺聚糖（6种）：二、核心蛋白均含有结合糖胺聚糖的结构域核心蛋白（coreprotein）为与糖胺聚糖链共价结合的蛋白质。核心蛋白均含有相应的糖胺聚糖取代结构域，一些蛋白聚糖通过这一结构锚定在细胞表面或细胞外基质的大分子中。1.大分子聚集型胞外基质蛋白聚糖2.小分子富含亮氨酸胞外基质蛋白聚糖3.跨膜胞内蛋白聚糖按核心蛋白和糖链成分的差别，蛋白聚糖分类：透明质酸连接蛋白核心蛋白硫酸角质素硫酸软骨素糖蛋白亚基骨骺软骨蛋白聚糖聚合物蛋白聚糖聚合物三、核心蛋白逐一加上糖基而形成蛋白聚糖在内质网上合成核心蛋白多肽链，同时在高尔基体内进行糖链延长或加工。多糖链的形成是由单糖逐个加上去的，糖醛酸由UDPGA提供；单糖要由UDP活化；硫酸由PAPS提供；糖胺氨基来自于Gln。2、糖组学的研究策略糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。目前糖组学关注的焦点是糖蛋白,为了更好地与蛋白质组学相关联,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为:(1)分析单物种生物所产生的所有聚糖;(2)以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因;(3)结合有效的理化和生化性质,研究糖蛋白糖链的性质。研究的重点在于:(1)编码糖蛋白的基因;(2)实际糖基化的位点;(3)聚糖结构;(4)糖基化的作用。主要分为三大部分:结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学;其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、前沿亲和层析技术等,功能糖组学主要包括微阵列技术等。3、糖组学研究技术进展1）结构糖组学根据与糖链连接方式不同,蛋白质主要有N－连接和O－连接两种糖基化形式:前者是糖链与蛋白Asn－Xxx－Ser/Thr序列子(Xxx为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的—NH2相连;后者则是糖链与蛋白Ser/Thr残基上的—OH相连。N－连接和O－连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面,也可以分泌型蛋白的形式存在。（1）糖蛋白的提取和分离纯化糖蛋白多定位于细胞表面,属于膜蛋白,水溶性不好,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜,然后用CHAPS等去污剂释放或TritonX－114相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用透析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化,其中由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析(seriallectinaffinitychromatography,SLAC)法是较好的方法。●SLAC研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/糖链。用于纯化糖蛋白/糖链的植物凝集素主要有刀豆凝集素(concanavalinA,ConA)、麦胚凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)、豌豆外源凝集素(pealectin)、植物血凝素(phytohaemagglutinin-E4,E4-PHA)和网孢盘菌凝集素(Aleuriaaurantialectin,AAL)等。单一一种凝集素并不能够富集细胞中所有的糖蛋白/糖链，因此科学家们在上世纪80年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱(seriallectinaffinitychromatography,SLAC)的方法来分离同一细胞中的各种糖蛋白/糖链。这种方法是将不同的凝集素亲和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可将不同的糖蛋白/糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白/糖链的回收效率和混合糖蛋白/糖链的分离效果。（2）糖链的释放纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放。糖链释放一般有化学释放和酶释放两种方法。化学法主要有肼解法,前