4卫生微生物研究和检测方法

2020/2/22裴晓方[e-mail]1第四章卫生微生物研究和检测的方法2020/2/22裴晓方[e-mail]2•卫生微生物检测的特点及基本原则•卫生指示微生物•卫生微生物研究和检测的方法•卫生微生物研究和检测方法的前景2020/2/22裴晓方[e-mail]3第一节•卫生微生物检测的特点及基本原则2020/2/22裴晓方[e-mail]41.卫生微生物检验与医学微生物检验的区别与特点?2.样品的采集原则？3.影响采样代表性的因素有哪些？4.怎样使采样具有针对性？5.样品采集后为什么要尽快送检？6.怎样保护样品中的待检微生物？7.样品中抑菌物质去除方法有哪些？8.样品的处理策略（目的）与方法9.怎样浓缩样品中的微生物？10.环境中的微生物数量低，怎样提高检出率？2020/2/22裴晓方[e-mail]5卫生微生物检测的特点1．检测的对象多病原微生物+非致病和条件致病微生物特别是能反映环境、食品、健康相关产品等样品卫生质量的卫生指示微生物。（学习后应能举例说明）2020/2/22裴晓方[e-mail]62．检测的范围广，标本的来源不仅局限于人体，也来源于空气、水、食品等环境。Sampling2020/2/22裴晓方[e-mail]73．检测的方法更敏感，以检测环境标本中数量很低的致病微生物。问题：你知道哪些方法？你认为什么方法更敏感？2020/2/22裴晓方[e-mail]84．定量测定和分型检测，以探明感染性疾病的传染源、传播途径、流行情况等。2020/2/22裴晓方[e-mail]9卫生微生物检测的基本原则采集、保存、运送、检测2020/2/22裴晓方[e-mail]10样品的采集原则2020/2/22裴晓方[e-mail]11现场调查的目的•查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因•进行卫生质量监测和评价2020/2/22裴晓方[e-mail]12总原则•生物安全•代表性/针对性•防污染•防杀菌•细标记2020/2/22裴晓方[e-mail]13生物安全•防人员感染：个人防护（？）•防标本和环境的污染：无菌操作、恰当处理污染废弃物2020/2/22裴晓方[e-mail]14•注意采样的代表性?注意2020/2/22裴晓方[e-mail]15•影响采样代表性的因素包括:–采样量–采样部位–采样时间–采样的随机性和均匀性–以及按批号抽样2020/2/22裴晓方[e-mail]16肉类生肉：取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌100g/只熟肉：酱卤制品，熏肉及灌肠取样应不少于200g，烧烤制品应取样50cm2熟禽：每份样品1只肉松：每份样品200g香肚：每份样品1个要在容器的不同部位采取采样方案的类型•二级采样方案：n、c、m•三级采样方案：n、c、m、Mn：同一批次产品应采集的样品件数c：最大可允许超出m值样品数m：微生物指标可接受水平的限量值M：微生物指标的最高安全限量值•注1：按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。•注2：按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。Example•n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g，含义是从一批产品中采集5个样品•若5个样品的检验结果均小于或小于等于m值（≤100CFU/g），则这种情况是允许的；•若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/g＜X≤1000CFU/g），则这种情况也是允许的；•若有3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间，则这种情况是不允许的；•若有任一样品的检验结果大于M值（＞1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。•在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案•对健康危害低的则建议使用三级抽样方案2020/2/22裴晓方[e-mail]202020/2/22裴晓方[e-mail]21注意采样的针对性•？•样品种类•恰当时间•采样量2020/2/22裴晓方[e-mail]22•避免采样时外界微生物对样品的新污染：所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。2020/2/22裴晓方[e-mail]23•避免采样时对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质：如容器是否有消毒剂的残留，或使用刚烧灼未冷却的采样工具。2020/2/22裴晓方[e-mail]24•注意对样品的详细标记：–样品名称–编号–采样时间–采样者–检测项目2020/2/22裴晓方[e-mail]25•COLLECTIONOFSAMPLES•Asample,consistingofaspecifiednumberofsampleunits(usuallyfive)drawnatrandomfromeachlot,shallbetaken.•Eachsampleunitshallconsistofatleast100mlorg,unlessstipulated(规定)inthemethod.•Collectoriginalunopenedcontainerwhereverpossible.2020/2/22裴晓方[e-mail]26•Iftheproductisinbulk,severalsampleunitscanbecollectedfromonecontainer,whileensuringthatthetotalnumberofsampleunitsarenotcollectedfromonecontainer•Morethanonesampleunitmayalsobecollectedfromlargeinstitutionalorbulkcontainerswhenthetotalnumberofsampleunitsrequiredexceedsthenumberofcontainersinthelot.2020/2/22裴晓方[e-mail]27•Placethecollectedsampleunitsinsterilecontainers.Asampleunitwillconsistofmorethanonecontainerwhenthelotconsistsofcontainerssmallerthan100mlorgeg.four25mlorgcontainersineachsampleunit.2020/2/22裴晓方[e-mail]28•Employaseptictechniquesincollectingthesampleunits.•Keepthesampleunitrefrigerated(0-4oC)orfrozen,dependingonthenatureoftheproduct,duringtransport.•Donotallowsampleunits,thatareusuallyfrozen,tothawduringshipment2020/2/22裴晓方[e-mail]29COLLECTIONOFSAMPLES•drawnatrandom•sampleunits(usuallyfive)•Eachsampleunitshallconsistofatleast100mlorg•Collectoriginalunopenedcontainer,usesterilecontainers,employaseptictechniques•Keeprefrigerated(0-4oC)orfrozen,avoidthawing2020/2/22裴晓方[e-mail]30样品的运送原则???2020/2/22裴晓方[e-mail]31•尽快送检！！！多快？为什么？2020/2/22裴晓方[e-mail]32采集的样品，应在规定的时间内（一般不超过3~4小时）送到实验室，尽快送检。一方面可减少待测微生物的死亡。另一方面可防止微生物的繁殖对计数结果的影响。2020/2/22裴晓方[e-mail]33保护待检微生物???2020/2/22裴晓方[e-mail]34保护待检微生物•温度调节•加入保护剂•去除其他不利于待测微生物生存的因素2020/2/22裴晓方[e-mail]35•低温2020/2/22裴晓方[e-mail]36•运送培养基：分离病毒的组织块可放于50%甘油缓冲液中（pH8.0），在5℃条件下保存数周，也可用由0.5%水解乳蛋白，2%小牛血清，青、链霉素各500u/ml，制霉菌素50u/ml组成的溶液保存。分离鼠疫菌等革兰染色阴性菌多用卡—布半固体培养基运送，用经1/15mol/LpH8.1磷酸盐缓冲液处理过的棉棒采样后，插入培养基的底部，拧紧管口螺旋盖运送。2020/2/22裴晓方[e-mail]37•pH•蛋白质•抑制剂抑制非目的微生物•渗透压•气体2020/2/22裴晓方[e-mail]38遵循完善的样品交接制度•送往实验室的样品，必须附有样品送检单，实验室收到样品应按送检单逐项核对，检查样品是否符合检验要求，确证无误方可签收待检。2020/2/22裴晓方[e-mail]39实验室检验原则2020/2/22裴晓方[e-mail]40•相应的硬件条件和设备•具有合格的检验人员•标准/公认的检验方法•实验室质量控制环境•实验室环境不应影响检验结果的准确性•工作区与办公区分开•工作面积应满足检验工作的需要•温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求•整体布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染•一般样品检验：洁净区（超净工作台或洁净实验室）•病原微生物分离鉴定：BSL-22020/2/22裴晓方[e-mail]42应有检测不同病原菌的相应的条件和设备微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等可分成不同的危害等级。在不同生物安全级别实验室进行2020/2/22裴晓方[e-mail]43•实验室生物安全与管理很重视?2020/2/22裴晓方[e-mail]44病毒灭活不彻底引发实验室感染•2004北京、安徽发生非典疫情原因调查结果。调查组认为，本起疫情来自中国疾控制中心实验室内感染，而引起实验室感染的环节，是腹泻病毒室工作人员进行实验时，对SARS病毒灭活不彻底。2020/2/22裴晓方[e-mail]45•因为非典病毒管理不善,7月1号，中国疾控中心主任李立明引咎辞职，疾控中心的另外4名负责人也受到了相应的处分。（中国疾控中心主任：行政记过、同意其辞去主任职务；中国疾控中心分管副主任：行政记大过、同意其辞去副主任职务；中国疾控中心病毒病预防控制所所长：行政撤职；中国疾控中心病毒病预防控制所分管副所长：行政撤职；中国疾控中心腹泻病毒室主任：行政撤职）2020/2/22裴晓方[e-mail]46疾控中心腹泻病毒研究室6项违规致2004春SARS重现2020/2/22裴晓方[e-mail]471———科研课题跨专业•腹泻病毒研究室是研究消化道病毒领域，却跨专业承担了非典的课题，工作人员专业不熟悉，造成了安全隐患。2020/2/22裴晓方[e-mail]482———安全管理不重视•工作人员采取新的灭活方法，未经学术委员会论证，科学依据不足，室主任擅自批准。有关灭活效果未经严格验证，没有验证方案、记录和内容。•其采用的灭活方法（1%NP