第1章-脑科学研究的方法

多学科综合神经科学神经解剖学神经生理学神经生物化学心理学………..第一章脑科学研究的方法和手段多层次的研究认知神经科学计算神经科学临床神经科学系统和行为神经科学发生神经科学细胞神经科学分子神经科学神经科学研究水平整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测分子水平的实验：离子通道、受体、酶、遗传物质等一、形态学方法二、生理学方法三、电生理学方法四、生物化学方法五、分子生物学方法六、脑成像（Brainimaging）技术一、形态学方法常规染色和特殊染色束（通）路追踪法荧光组织化学法原位杂交法受体定位法神经系功能活动形态定位法1.常用普通染色方法TTC染色HE锇酸染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色HE（苏木素－伊红）锇酸染色是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，它本来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以用于有髓神经纤维的染色锇酸染色氯化金浸染运动终板Ach荧光染色氯化金浸染Cajal银浸染色尼氏染色多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色2、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系束路追踪原理：轴浆运输示踪物质：HRP，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。观察：根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法。轴浆运输法—利用神经元轴浆运输现象的追踪法.追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、荧光染料包括核黄(nuclearyellow)、固蓝(fastblue)及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、细菌毒素如霍乱毒素、病毒如活的神经病毒(胞疹病毒和弹状病毒）变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反应，来研究纤维的联系。*物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。*化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）、单胺类神经毒（６－羟多巴胺、６－羟多巴、双羟色胺）神经元质膜荧光染料法：用羰花青（carbocynine）荧光染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标本上追踪纤维联系。最新研究进展：华人学者绘制小鼠大脑神经网络图不同的大脑区域必须相互沟通才能控制复杂的思想和行为，但目前对于这些区域组织成为广阔神经元网络的机制却相对知之甚少。2014年2月27日《细胞》（Cell）杂志上的一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员采用神经元示踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见的荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质的不同区域，这些小分子沿着“细胞高速公路”运输，标记了大约600个神经元通路。研究人员采用高分辨率显微镜扫描了这些大脑区域，构建出了皮质连接的图像数据库。当研究人员分析这些连接时，他们发现大脑皮质是一个高度组织化的网络，由八个子网络构成，它们协调活动反映动物的情感和感觉。并且，子网络之间以一种非常特殊的方式来共享这一信息。“这些研究发现挑战了流行假说：大脑皮质是一个单一的网络，在这一网络中所有一切都密集连接在一起。”接下来，研究人员可将来自这一重要哺乳动物模型系统的解剖数据与大量现有的分子遗传数据合并来鉴别神经细胞基本类型。“确定全脑的结构组织将是朝着揭示脑功能以及在神经系统疾病中功能障碍的结构基础迈出的基本且令人兴奋的一步，”董宏伟说。我们真的会永远不老吗？——从“科学狂人”的抗衰老研究说起JohnCraigVenter的身上从不缺乏话题。从单枪匹马与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基因组计划代表FrancisCollins同时选为封面人物，到宣布制造出首个能够自我复制的活细胞“Synthia”，轰动了整个学术界，Venter的每一个举动，在学术界都会引起波澜。前阵子，他又宣称将组建新公司HLI，组建史上最大的基因组数据库，结合基因组学、生物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长人类寿命。【为什么我们会追求不老和长寿】对于不老和长寿的探索，恐怕是除了“我们是谁”“我们从哪儿来”之外，人们思考的第三个问题了——“我们能否一直存在下去”。【对衰老和长寿的基因研究】有一个规律，很多问题，如果解释不了，就说它是由于基因决定的，多半错不到哪里去。也因此，生物学家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合，从基因的角度开始对长寿和衰老问题的探索。目前基因方面的研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里说的并不是单一的基因，而是与长寿和衰老有关的多种基因，它们之间的相互作用带来了不老和长寿的结果。衰老的表现为染色体端粒长度的改变、DNA损伤、甲基化等，衰老的终点就是死亡，这些因素也是影响长寿的原因。有科学家认为，端粒（细胞核两端的特殊DNA片段）长度决定生物的寿命，端粒的缩短会导致细胞分裂的停止和死亡的来临。发现端粒的三位科学家获得了2009年诺贝尔生理学或医学奖。目前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者认为，消除自由基的某些酶类基因、与细胞生长调控有关的某些基因与长寿和衰老相关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发现更多的相关基因，理清那些导致衰老、影响长寿的基因群及其之间的联系，才能在理解基因组的基础上，解决衰老、长寿的问题。【其他长寿和抗衰老的办法】除了基因研究外，还有抗衰老制剂的研究。褪黑素与微量元素是被认为有抗衰老作用的物质。褪黑素的自由基清除能力在众多自由基清除剂中表现特别突出，而微量元素摄入不协调，将导致衰老。还有一种说法，节食能够延长寿命。这背后的生物学原理是：生长激素和胰岛素信号途径在起作用。科学家通过对猴子、酵母菌、果蝇等动物的研究中验证了减少卡路里摄入能够延长寿命的理论。另一些科学家提出引起机体衰老和疾病的是自由基的增多，这也是现实生活中那些宣称“清除自由基，恢复年轻态”的保健品所依赖的理论基础。这些保健品疗效有限，请不要轻易尝试。除了遗传因素之外，人生活的环境、人的心理状况等多方面因素都会影响到寿命。保持愉悦的心情，健康的生活方式，良好的饮食习惯，这样即使躯体不可避免的老化，但还是有年轻的心态，总好过长寿但不快乐，年轻的外表下，却住着一个老灵魂。对于长寿基因及衰老基因的发掘，也有不赞同的声音。他们认为这违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化的要领“生存和繁殖”，也会越来越少的被考虑，我们将剥夺后代的生存机会。技术的进步带来的潜在社会问题，还有待进一步去解决。就目前的研究状况来看，长寿不意味着不会永生，科学的帮助下，人们有机会将有限的生命拉长，将有限的生命过得更有质量，实现不老不病的愿望。此时又想到了Venter先生，据悉，Venter曾作为美国海军医疗队的医院参加越战，战场的残酷使他认识到生命和时间的宝贵，他认为人生的每一分钟都应该有所创新。撇开进化的需要不谈，试想有一天，我们不再会变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生即知将死的时候那样，珍惜生命中的每一天，而努力奋斗呢。3、荧光组织化学法用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。基本过程有：固定、制片、反应等三步。免疫组织化学反应：有直接法和间接法双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起内的共存现象，或含两种不同化学物质的相互关系。免疫组化根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。4、原位杂交法此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。5、受体定位法：研究受体在神经系统内的定位配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位免疫组织化学法：用针对受体的抗体6、神经系功能活动形态定位法脱氧葡萄糖法：原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区别地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖-6-PO4，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。c-fos(Fos)法：c-fos是一种原癌基因，属于即刻－早期基因类(immediate-earlygene).很多刺激条件可通过第二信使引起神经元c-fos的表达增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻译成的Fos蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因c-jun所产生的蛋白Jun构成二聚体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列的细胞反应。细胞色素氧化酶法：神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺激的结果。二、生理学方法损毁法刺激法周身给药法脑室注射法脑组织培养亚细胞分析神经递质释放量的测定神经递质的功能测定行为学方法最常用的有两种：神经行为学、电生理学1、神经递质释放量的测定（在体invivo和离体invitro)推挽灌流法：在体研究中枢核团递质释放的有用方法。通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。脑透析术(braindialysis)：在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变化过程。脑透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定量分析仪。抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放。硼硅玻璃与r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针脑片灌流法突触体灌流法2、神经递质的功能测定微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。抗体微量注射：特异性的抗体注射在某些部位，可中和神经末梢释放出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，抗体微量注射所引起的功能变化可解释为消除该神经肽的生理效应的结果。生物检测（Bioassay）:经典的方法.如用水蛭背最长肌测定ACh的作