透射电镜的基本原理

2020/2/23电镜室1第一章透射电子显微镜的原理与操作主讲:吴金浪2020/2/23电镜室22020/2/23电镜室32020/2/23电镜室42020/2/23电镜室52020/2/23电镜室62020/2/23电镜室72020/2/23电镜室82020/2/23电镜室92020/2/23电镜室102020/2/23电镜室112020/2/23电镜室122020/2/23电镜室132020/2/23电镜室142020/2/23电镜室152020/2/23电镜室162020/2/23电镜室17一、电子显微镜的发展简史2020/2/23电镜室1820世纪30年代，卢斯卡（E.ruska）发明了世界上第一台透射式电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)，并且成功地得到了一张由电子束作为光源形成的铜网放大像。当时放大倍数仅有12倍。到1934年--电子显微镜的分辨率提高到50nm，放大倍数达到1万倍。。电子显微镜的发展简史2020/2/23电镜室191935年电子显微镜基本定型。1939年德国西门子公司生产了世界上第一批作为商品的透射式电子显微镜，分辨率优于10nm，放大倍数达到10万倍。60年代---透射式电子显微镜的分辨率达到0.5nm。70年代末--电子显微镜的点分辨率已优于0.3nm，晶格条纹分辨率达到0.14nm.实现了人们早就向往的对原子像和晶格像的观察。电子显微镜的发展简史2020/2/23电镜室2080年代--电子显微镜已发展成为一种综合分析仪器。例如，安装配有计算机系统的能量分析谱仪，对样品进行元素的成分分析。样品室内亦可装配加热、冷却、大角度倾斜、拉伸样品台等附件。电子显微镜的发展简史2020/2/23电镜室21扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)是显微镜世家中的一位后起之秀。自第一台定型的透射式电子显微镜产生后，法国卡诺尔就提出了扫描电子显微镜的设计思想和工作原理。到1942年剑桥大学首次制成世界上第一台扫描电子显微镜。由于扫描电子显微镜使用范围广，并具备分辨率高、图像立体感强、放大倍率选择范围广、样品适应性大、制样方便等优点。所以后期发展速度比透射式电子显微镜快的多。70年代已发展成为性能完善，自动化程度高，功能齐全的一种电子光学仪器。电子显微镜的发展简史2020/2/23电镜室222020/2/23电镜室232020/2/23电镜室242020/2/23电镜室252020/2/23电镜室262020/2/23电镜室272020/2/23电镜室28电子显微镜种类电子显微镜种类：由于电子与物质相互作用会产生透射电子、弹性散射电子、能量损失电子、二次电子、背反射电子、吸收电子、X射线、俄歇电子、阴极发光和电动力等等。电镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。主要分为透射式电子显微镜(简称透射电镜，transmissionelectronmicroscope，TEM)和扫描电子显微镜(简称扫描电镜，scanningelectronmicroscope,SEM)两大类。2020/2/23电镜室292020/2/23电镜室302020/2/23电镜室31扫描透射电子显微镜(简称扫描透射电镜，STEM)则兼有两者的性能。为了进一步表征仪器的特点，有以加速电压区分的，如：超高压(1MV)和中等电压(200~500kV)透射电镜、低电压(~1kV)扫描电镜；有以电子枪类型区分的，如钨灯丝电镜、场发射电镜；有以用途区分的，如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、双束扫描电镜(FIB)等。有以激发的信息命名的，如电子探针X射线微区分析仪(简称电子探针)等。电子显微镜种类2020/2/23电镜室32二、透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室33就最基本的原理来说，透射电镜和光学显微镜是相同的，它们的显微放大过程基本相似，而且电镜的光路和部件术语也同光镜基本一样。不同的是，电镜的照明源不是可见光而是电子束；透镜也不是玻璃而是轴对称的电场或磁场，并且电子显微镜的总体结构、成像原理、操作方式等与光学显微镜有着本质上的区别。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室34光源中间像物镜试样聚光镜目镜毛玻璃电子枪聚光镜试样物镜中间像投影镜观察屏照相底板照相底板2020/2/23电镜室35透射电镜的基本原理如下：(一)分辨本领与放大倍数---分辨本领是指能够分辨物体上两点之间的最小距离。光学显微镜的分辨极限为O.2μm，而电镜的分辨本领可优于2Å，相差达l000倍，因为影响光镜提高分辨本领的主要因素是由于光线的衍射作用。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室36第三章生物医学超微结构分析透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室37光学显微镜的分辨本领由阿贝公式决定式中d为分辨本领，λ为照明波波长，n为物体与物镜之间介质的折射率，α为物体上的点与物镜所成夹角的一半。普通光学显微镜用油浸镜头时n≈1．5，α90。即sinα1，用可见光作照明源时，其平均波长约为5000Å，那么，它的分辨本领约为2000Å。这说明光学显微镜只能分辨大于2000Å的结构。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室38要提高分辨本领，必须采用波长短的照明源。电子显微镜的照明源波长约为0.05Å，目前最好的电镜分辨本领已达1．4Å，比光学显微镜提高了1000多倍。---放大倍数是指物体经过仪器放大后的像与物的大小之比。不能增加图像细节的放大倍数称为空放大，而与分辨本领相应的最高放大倍数称为有效放大倍数，为眼的分辨本领与仪器的分辨本领之比。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室39透射电镜的基本原理目前商品电镜的分辨本领可达到2Å，其有效放大倍数为（倍）即100万倍。这个倍数可以从电镜上直接得到，也可在摄制20万倍的底片后再以光学放大5倍来获得。因此，标示电镜性能的主要指标是分辨本领而不是放大倍数。2020/2/23电镜室40(二)电子束的产生电子束是电镜的照明介质。目前大多数电镜的电子束是由热阴极、控制极和阳极构成的三极式电子枪产生，其示意图:透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室41透射电镜的基本原理加速极（阳极）电子束灯丝（阴极）控制极（栅极）2020/2/23电镜室42阴极（灯丝）控制极（栅极）阳极（加速极）电子束聚光镜试样2020/2/23电镜室43透射电镜的基本原理阴极又称为灯丝(包括钨丝、六铍化镧等)，通常用钨丝制成，通电加热后灯丝内的自由电子热运动增加并逸出表面，在加速电压作用下，阳极相对阴极形成正电场，逸出阴极的电子在正电场力作用下高速飞向阳极，中心部分的电子因惯性而穿过阳极孔成为照明电子束。2020/2/23电镜室44控制极靠近阴极表面，相对阴极加上数百伏的负电位，调节电位高低可以控制阴极发射电子的数目，亦即调节了电子束的强弱。钨阴极在使用时，由于金属蒸发和电子枪内残余气体的侵蚀，寿命一般为几十小时。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室45(三)电子透镜及其作用运行中的电子束只有在通过电场或磁场时才能改变其运动轨迹。轴对称的电场或磁场可以使电子束聚焦，故称为电子透镜，前者叫静电透镜，后者叫磁透镜。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室46透射电镜的基本原理BA线圈磁场对电子射线的作用2020/2/23电镜室47磁透镜使电子会聚的原理OO’z电子在磁透镜中的运动轨迹AC2020/2/23电镜室48一束电子的螺旋形轨迹是相似的。为便于理解，可设想将其外周包络起来而不考虑其有否旋转，则包络线的形状基本上和光学玻璃会聚透镜的光路相似。现代的电磁透镜是在线圈外面套上铁壳作磁路，并在铁壳中心置有极靴(polepiece)，使线圈通电后产生的磁场高度集中而又均匀地分布在极靴中心。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室49Oz带铁壳的带极靴的透镜O’2020/2/23电镜室50有极靴B（z）没有极靴无铁壳z磁感应强度分布图2020/2/23电镜室51透射电镜的基本原理电磁透镜的焦距决定于磁场强度，磁场强度决定于通过线圈的电流强度。因此，可以调节激励电流来改变磁场强度，从而达到改变放大倍数和进行图像调焦的目的。由于电磁透镜像差小，调节容易，因此为现代电镜所普遍采用。但有些电子透镜不必改变焦距，可采用磁钢制造形成永久磁场，即为永磁透镜。2020/2/23电镜室52透射电镜的基本原理电子透镜的缺陷球差---球差是由于电子透镜的中心区域和边沿区域对电子的会聚能力不同而造成的。结果在象平面成了一个满散圆斑。象散---磁场不对称时，就出现象差。有的方向电子束的折射比别的方向强，这样，圆形物点的象就变成了椭圆形的漫散圆斑。色差---电子的能量不同，从而波长不一造成的，电子透镜的焦距随着电子能量而改变，因此，能量不同的电子束将沿不同的轨迹运动。产生的漫散圆斑还原到物平面。2020/2/23电镜室53(四)反差与成像反差就是像与背景在亮度上的差别。在电镜中，当电子束中的电子碰到样品中的原子核时，电子轨道将偏斜一个角度，这种相互作用的过程称为弹性散射。弹性散射的强度与样品元素的原子序数成正比，原子序数愈高，对入射电子的散射能力就愈大。在物镜的后焦面上装一接地的光阑，散射角度大的电子被光阑截获而除去，仅让透射电子和散射角小的电子穿过光阑孔参与成像，从而形成反差。这个光阑孔越小(通常为20～30μm)。被截除的散射电子便越多，像的反差也就越好。透射电镜的基本原理2020/2/23电镜室54透射电镜的基本原理物镜光栅在成像中的作用透镜极靴活动光栅成像电子样品入射电子散射电子2020/2/23电镜室55透射电镜的基本原理生物组织样品主要由原子序数很低的碳、氢、氧、氮等元素组成，在电镜中不能直接形成反差，因而不能成像。为了获得生物样品的反差，必须对样品进行电子染色，即在样品制备过程中使组织块或超薄切片与重金属盐类(如锇、铀、铅)相作用，使组织中的某些结构结合(化合、吸附)重金属元素，从而增加这些结构对电子的散射能力以获得反差，使样品显示出清晰的结构来。2020/2/23电镜室562020/2/23电镜室57三、透射电镜的使用2020/2/23电镜室58(一)快速检查合轴的方法合轴的好坏直接影响着电镜的性能，所以使用前有必要对电镜的合轴进行检查。快速检查合轴的步骤：1.将光斑聚到最小，降低灯丝发射电流，调出灯丝像，检查灯丝发射是否均匀。2.反复微量改变第二聚光镜激励电流，观查光斑是否出现椭圆形，以判断聚光镜是否有像散。透射电镜的使用2020/2/23电镜室59透射电镜的使用2020/2/23电镜室60透射电镜的使用灯丝电流逐步增大时光斑图像变化2020/2/23电镜室61消像散时光斑图像变化2020/2/23电镜室623．调物镜激励电流从最大到最小(允许使用者观察电镜时调焦用的最大钮)，反复调整，观察光斑中心是否偏离荧光屏中心。如有偏离说明照明系统与成像系统合轴不佳。4．放入样品聚好焦，找一标记移置荧光屏中心，然后向欠焦的方向(减小物镜激励电流的方向)调中聚焦钮6～8档，观察标记是否偏离荧光屏中心，如有偏离说明电流中心合轴不好。透射电镜的使用2020/2/23电镜室635．选择样品上颗粒密集的地方，在高倍数下改变物镜激励电流，若图像出现方向性的结构，说明物镜有残存象散。上述五步的检查，基本上可以判断电镜合轴是否合格。透射电镜的使用2020/2/23电镜室64(二)操作钮(键)参量的选择及使用方法操作钮(键)的参量是使用者根据样品、分析、记录等要求而定。1．加速电压值的选择在许多电镜中，高压分为20kV、40kV直到100kV，或者更高。所以存在选择的问题。首先分析加速电压对电镜有关参量的影响。(1)加速电压越高，电子波长越短，分辨率增高。(2)加速电压越高，对于给定的一个样品，穿透能力越强，图像亮度提高。但振幅反差下降。透射电镜的使用20