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温度、pH等对酶促反应速度的影响一.实验目的了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。二.实验原理温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。PH值影响酶促反应速度，是由于酶本身是蛋白质。PH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激动剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激动剂。凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。三.试剂器材试剂⑴0.5％淀粉液⑵0.5％NaCl溶液⑶不同pH值缓冲溶液的配制:①1/15mol/LKH2PO4液：称取纯KH2PO49.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。②1/15mol/LNa2HPO4液：称取Na2HPO4·2H2O11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.06.68.01/15mol/LKH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.00.9⑷1％CuSO4溶液器材水浴锅、电驴、比色盘、试管吸管、烧杯三.实验方法及步骤制备稀唾液：用清水漱口，含蒸馏水少许，咀嚼以刺激唾液分泌。在小漏斗中垫入一块薄薄的脱脂棉，直接将唾液吐入漏斗过滤。取过滤的唾液2ml加蒸馏水18ml混匀备用。（一）温度对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉溶液3．03．03．0PH6.6缓冲液1．01．01．0现象颜色变化2.混匀后，将1号、2号、3号试管分别置于沸水浴、温水浴（37～40℃）和冰水浴中5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向各试管中加入稀唾液1ml混匀，15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色变化并予以分析。（二）pH对酶促反应速度的影响1.取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉液3．03．03．0PH5.0缓冲液1．0PH6.6缓冲液1．0PH8.0缓冲液1．0稀唾液1．01．01．02.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃）中保温，此间每隔1分钟从第二管中取反应液1滴与碘混合观察颜色变化并记录。待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各试管加碘液1滴，观察颜色并解释结果。（三）激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.5％淀粉液2．02．02．0PH6.6缓冲液1．01．01．0蒸馏水1．00.5％NaCl溶液1．00.5％CuSO4溶液1．0稀唾液1．01．01．02.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃）中保温，每隔1分钟在比色盘上用碘检查第二管，待碘不变色时，冷却后分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释结果。试剂⑴0.5％淀粉液⑵0.5％NaCl溶液⑶不同pH值缓冲溶液的配制:①1/15mol/LKH2PO4液：称取纯KH2PO49.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。②1/15mol/LNa2HPO4液：称取Na2HPO4·2H2O11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH5.06.68.01/15mol/LKH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.00.9⑷1％CuSO4溶液琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察一.实验目的通过实验进一步加深对竞争性抑制作用的理解。二.实验原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在无氧条件下，从琥珀酸脱下的氢可由甲烯蓝（蓝色）接受，甲烯蓝被还原成甲烯白。因此，可从加入的甲烯蓝的褪色情况来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的影响。丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。三.试剂与器材试剂⑴0.2mol/L琥珀酸⑵0.2mol/L丙二酸⑶0.02mol/L丙二酸以上四种溶液均先用5mol/LNaOH调节至pH7，再用0.01mol/LNaOH调节至pH7.4。⑷1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液：量取1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO4溶液19.2ml混合即成。⑸0.02％甲烯蓝。⑹液体石蜡。器材水浴锅、小烧杯、试管、漏斗四.实验方法及步骤1.组织提取液（琥珀酸脱氢酶）的制备：取新鲜肝或肌肉组织3g，，用蒸馏水冲洗，剪成小块，将组织碎块置于研钵加pH7.4磷酸缓冲液3~4ml及细砂研成匀浆，然后加1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液6~7ml,混匀，用双层纱布过滤，滤液即为组织提取液。2.取干净试管4支，标号后按下表操作：试管号试剂（滴）1234组织提取液1010100.2mol/L琥珀酸44440.2mol/L丙二酸40.02mol/L丙二酸4蒸馏水4140.02％甲烯蓝2222记录颜色变化3.将上述各管摇匀，在液面上滴加液体石蜡10滴以隔绝空气，然后置于37℃水浴中保温10分钟，观察各管甲烯蓝褪色情况，比较哪一管快（记录所需时间）而且比较彻底，并予以解释。各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。为什么？4．各管置于37℃水浴中，半小时内观察各管颜色变化，比较其速度并说明原因。然后将第1管用力摇动，观察其有何变化？为什么？米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定[原理]在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。底物浓度[S]VmaxV底物浓度对反应速度的影响底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：式中v——反应速度；Km——米氏常数；Vmax——酶反应最大速度；[S]——底物浓度。从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。[方法和步骤]1、制作标准曲线取9支试管，按0～8编号。1～8号管分别加入0.1至0.8mL酚标准应用液，并用蒸馏水将各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。各管各加1mol/L碳酸钠溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀后，35℃保温显色10分钟。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A680。整个操作过程见下表：管号123456780酚含量/μmol0.040.080.120.160.200.240.280.32-0.4mmol/L酚标准应用液/mL0.10.20.30.40.50.60.70.8-蒸馏水/mL0.90.80.70.60.50.40.30.21.01mol/L碳酸钠溶液/mL222222222Folin-酚稀溶液/mL0.50.50.50.50.50.50.50.50.5以酚含量(μmol)为横座标，以A680为纵坐标，绘制标准曲线。2、测定Km、Vmax取试管7支，按照0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol/LpH5.6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，摇匀，精确反应15min。各管反应时间到达后立即加入1mol/L碳酸钠溶液2mL，摇匀，再加入Folin-酚稀溶掖0.5mL，35℃保温显色l0min。0号管内最后加入0.5mL酶液，其它操作与上述各管相同。冷却后以0号管作空白，在可见光型分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度A680。在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。管号1234560磷酸苯二钠终浓度/mmol×L-10.50.751.01.251.502.505mmol/L磷酸苯二钠/mL0.100.150.200.250.300.500.50.2mmol/L乙酸盐缓冲液/mL0.40.350.300.250.2000稀释酶液/mL0.50.50.50.50.50.50.5(最后加入)1mol/L碳酸钠溶液/mL2222222Folin-酚稀溶液/mL0.50.50.50.50.50.50.5A680[结果与计算]1、从酚标准曲线上查出各管A680相当的酚含量，计算各种底物浓度下的反应初速度v。2、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求出Km和Vmax。碱性砱酸酶Km数值的测定一.实验目的通过碱性磷酸酶掌握一般酶Km值的测定原理和方法。二.实验原理当温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系可用米－曼（Miechaelis-Menten）氏方程式表示，km值是反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度，但由于用v与[S]作图法求Km不方便，所以常用由米－曼氏方程式推导出的林－贝（Lineweaver-Burk）氏方程式，即1/V与1/[S]的直线关系作图，求出Km值。本实验以碱性磷酸酶为例，学习一般的Km测定方法。碱性磷酸酶是一组酶，能水解多种磷酸脂，如磷酸苯二钠、3-磷酸甘油等，其最适pH为10左右。本实验以磷酸苯二钠作为底物，反应式为：C6H5O-PO3Na2+H2OC6H5OH+Na2HPO4反应产生的酚使酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原生成钼蓝及钨蓝，测其吸光度值。以吸光度代表反应速度，用吸光度的倒数与底物浓度的倒数按林-贝氏作图法，在横轴上的截距求Km值。三、试剂与器材试剂⑴1mol/L磷酸苯二钠：称取127mg磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至500ml，加2ml氯仿防腐，置棕色瓶中放冰箱保存，可用一周。⑵1mol/L乙醇胺缓冲液（pH10.1）：称取乙醇胺（NH2CH2CH2OH）61.1g加蒸馏水800ml，0.3ml/L氯化镁1.0ml，5％吐温8020ml，混匀后用浓盐酸校正pH至10.1±0.05,再加水至1000ml。⑶碱性磷酸酶(0.1mg/ml)：取纯化碱性磷酸酶试剂10mg，加pH10乙醇胺缓冲液至100ml。⑷酚试剂：于1500ml圆底烧瓶内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、蒸馏水700ml、85％磷酸50ml及浓盐酸100ml。装接冷凝器于瓶上，慢慢加热回流10小时。再加Li2SO4·2H2O150