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课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照1、实例：PCR技术启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：⑴抑制大多数微生物的生长⑵促进目的菌株的生长结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基尿素尿素6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果只生长尿素细菌生长多种微生物是1、显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。“微生物的天然培养基”[一]土壤取样数量最大、种类最多大约70%—90%是细菌◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。[二]制备培养基由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板（三）样品的稀释问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。微生物的培养与观察[一]无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。[三]规划时间三、四.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。五.课外延伸大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征本课题知识小结:1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素实践训练CD3.下列说法不正确的是（）A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质C.青霉素类药物D.高浓度食盐BC5、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是A链霉素能阻止结核菌的生长B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效D链霉素可以用于治疗伤寒病人D