五 高血压的基因研究与基因治疗进展

高血压的基因研究与基因治疗进展绿色包装与生物纳米技术实验室高血压是一种以体循环动脉收缩压（SBP）和（或）舒张压（DBP）升高为特征的临床综合征，它是目前临床最常见、最重要的心血管疾病之一。第一节高血压的基因研究血压及高血压血压的形成血容量血管张力心输出量高血压的形成血容量过多血管张力增加心输出量上升美国高血压预防、评价和治疗联合委员会第六次会议报告：理想血压：120/80mmHg正常血压：130/85mmHg正常高限：130～139/85～89mmHg高血压：≥140/90mmHg(18.7/12.0kPa)高血压：1级：收缩压140-159mmHg或舒张压90-99mmHg2级：收缩压160-179mmHg或舒张压100-109mmHg3级：收缩压≥180mmHg或舒张压≥110mmHg高血压原发:90%继发:10%肾脏疾病、内分泌疾病如嗜铬细胞瘤等高血压的病因（1）由于血压升高促成心肌细胞肥大→心脏肥厚或扩大→瓣膜闭合不严→血液回流→心力衰竭。2）由于血压升高→脑部血管缺血形成动脉硬化→脑血栓或脑出血。（3）由于血压升高→肾小球压力升高→肾小球萎缩→肾动脉硬化缺血→肾功能衰竭。（4）长期高血压或血压急骤增高→视网膜渗血和出血直接并发症中枢神经节末梢递质释放突触后膜受体血管平滑肌二、体液调节：肾素-血管紧张素-醛固酮系统肾脏邻球肾素转化酶小动脉收缩旁器血管紧血管紧血管紧张素原张素Ⅰ张素Ⅱ醛固酮分泌→水钠潴留可乐定-甲基多巴莫索尼定美加明利血平胍乙啶普萘洛尔1哌唑嗪1拉贝洛尔肼屈嗪硝普钠硝苯地平米诺地尔-R阻断药ACEI(卡托普利)氯沙坦利尿药(噻嗪类)一、神经调节：交感神经系统对高血压形成密切关联的主要候选基因一、肾素血管紧张素系统(Renin-AngiotensinSystem,RAS)肾素是一种蛋白分解酶,主要在肾内但也可在肾外组织合成、储存和分泌,它本身无生理活性,其作用在于激活由肝脏合成的血管紧张素原（AGT）,使其转化为血管紧张素Ⅰ,并在血管紧张素转换酶(ACE)的作用下水解形成血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)。ACE还能裂解缓激肽(bradykinin,BK)等,从而使ATⅡ增加,使BK等抗高血压物质失活而升高血压。AT1和AT2受体的功能二、激肽释放酶-激肽系统缓激肽是体内最强的血管舒张物质之一。缓激肽通过与缓激肽β2受体结合可引起全身小动脉舒张，显著降低外周血管循环阻力，血管通透性增强，从而引起血压下降。缓激肽β2受体基因可能是原发性高血压等心血管疾病的致病候选基因之一。缓激肽β2受体基因启动子区域存在T-58C多态性，其-58C等位基因突变使受体数目减少，血管的舒张能力降低，产生高血压。三、交感神经-肾上腺素系统交感神经引起血压升高的机制：①作用于血管α受体，使小动脉收缩，增大外周阻力②通过兴奋心脏的β受体使心脏收缩加强、加快，从而提高心输出量；③直接或间接激活RAS系统进而收缩血管和通过血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）促进醛固酮分泌，增加血容量。β2肾上腺素受体遗传多态性可能参与高血压的发病机制。目前在β2肾上腺素受体基因的启动和编码区共报道了17个单核苷酸多态性，其中G16R多态性很常见。四、G蛋白&信号传导系统G蛋白信号调节因子可与多种心血管激素（如血管紧张素和去甲肾上腺素）偶连。G蛋白亚基编码基因多态性对心血管系统有明显影响。其中G蛋白β3亚基基因多态性被认为是研究心血管药物基因组学最佳候选基因。文献报道，G蛋白β3亚基基因第10外显子825位存在C→T核苷酸转换，825T等位基因与白种人高血压相关。第二节高血压的基因治疗研究一、基因治疗的概念基因治疗指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中,以补充缺失基因或置换致病基因,从而产生新的表型的一种治疗方法。基因治疗的临床应用1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的4岁女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。1994年，中国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。二、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法回体转移法在体直接转移法三、基因治疗的基本策略(1)基因置换：是用有功能的正常基因置换致病基因,达到彻底治愈。(2)基因修正：将突变碱基序列修正,正常序列保留,恢复其正常功能。(3)基因修饰：是将目的基因导入缺陷细胞或其他细胞,目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有功能加强。(4)基因失活：就是运用反义技术特异封闭某些基因的表达,以达到抑制某些有害基因的表达。原发性高血压发病涉及多个基因,具体缺陷基因仍未彻底阐明,现在还不能通过基因置换和基因修正来达到彻底治愈高血压的。目前的基因治疗还停留在使用基因修饰和失活的方法增强舒血管物质的表达及减少缩血管物质的表达,以达到类似药物降压的效果。高血压基因治疗的策略主要有两种:1)降低基因表达(knockdown):以能升高血压和加速心血管病理的基因为主,特别是肾素血管紧张素系统(RAS);2)诱导基因表达(over-expression):以降低血压有关的基因为靶基因,如心房利钠肽、内皮型一氧化氮等。四、高血压与缩血管基因的抑制（一）降低基因表达的反义技术反义技术是根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)分子，导入靶细胞或机体后与DNA或mRNA分子杂合,从而封闭或抑制特定基因的复制或转录，减少一些致高血压蛋白质的形成。血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)是RAS系统中的重要成员之一,参与血管紧张素的形成和高血压的产生。2011年Kmiura等利用重组腺病毒作载体携带的AGT基因的ASODN,试验中给予5d龄的(spontaneouslyhypertensiverats,SHR)大鼠一次心内注射该载体,可延迟发生高血压91d,治疗中收缩压可下降23mmHg,且转染后ASODN在肝、肾、心脏中稳定发挥作用,明显降低肝脏中AGT水平,减轻左室心肌肥厚。1.血管紧张素原反义基因疗法2.Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(ATⅠR)基因反义基因疗法ATⅠR和血管紧张素Ⅱ结合,产生强大的缩血管效应Wang等用反转录病毒携带AT1R-ASODN转染细胞，在体外及SHR体内试验中均能明显降低AngII效用,达到降低血压的目的。3.血管紧张素转换酶反义基因疗法血管紧张素转换酶(ACE)能使无活性的血管紧张素Ⅰ末端裂解2个氨基酸,形成强烈的收缩血管物质AngⅡ,引起血压升高。Wang等以逆转录病毒为载体将ACE-ASODN心内注射给5日龄的SHR,结果发现,产生的降压作用明显而持久,BP降低13-17mmHg,并且能够减轻心室肥大,阻断肾脏和血管内皮的病理性变化。4.其他一些基因,如酪氨酸羟基酶、β1肾上腺素能受体、血管紧张素基因活化素等基因的ASODN也都是有降低血压作用。（二）降低基因表达的RNA干扰技术RNA干扰(RNAinterference,RNAi),是近年才发现的自然界进化上高度保守而普遍存在的一种现象,是一种重要的转录后基因沉默机制。在设计小干扰性RNA的靶位点时，应尽量选择对靶mRNA特异、而与其他内源性基因无同源性的核苷酸序列。小干扰性RNA诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在小干扰性RNA上一个错配的碱基对即可使其失去原有的抑制基因表达的活性。换言之，只有与小干扰性RNA高度同源的mRNA才会被降解。这一特性在将RNA干扰技术用于治疗人类疾病时极为重要，为减少或避免抑制不相关基因奠定了基础。Wang等用针对肾上腺盐皮质激素受体(mineralcorticoidreceptor,MR)的重组子腺相关病毒携带短发夹小干扰RNA(AAV.MR-shRNA)来检测其对肾盐皮质激素受体的抑制和对冷诱导高血压(cold-inducedhypertension,CIH)的控制能力。结果发现,AAV.MR-shRNA治疗组CIH大鼠在基因导入后3周内血压无增高，单剂量注射AAV.MR-shRNA的大鼠其抗高血压作用至少维持3周。(三)降低基因表达的圈套技术基本原理是:合成与顺式元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs),被称为圈套ODNs,转染入细胞,竞争性抑制反式因子转录因子)与顺式元件的结合,干扰转录因子的DNA结合活性及其后续基因的表达。圈套策略示意图在正常状态下，转录因子（TF）与顺式元件（Cis-E）结合，导致靶基因的持续表达。与顺式元件序列一致的圈套寡核苷酸（decoysODNs）能结合TF，阻止TF与Cis-E的相互作用，抑制靶基因的转录表达。反义ODN和圈套ODN的作用原理TransfectionofdecoybutnotmismatchedODNagainstAGEresultedinatransientdecreaseinbloodpressureofspontaneouslyhypertensiverats(SHR),accompaniedbyareductioninplasmaangiotensinogenandangiotensinIIlevels.MorishitaR,HigakiJ,TomitaN,AokiM,MoriguchiA,TamuraK,MurakamiK,KanedaY,OgiharaT.Roleoftranscriptionalcis-elements,angiotensinogengene–activatingelements,ofangiotensinogengeneinbloodpressureregulation.Hypertension.1996;27:502–507.(AGE)2：Thetranscriptionalcis-elements,angiotensinogengene–activatingelements五、高血压与“扩血管基因”增强1.激肽释放酶(kallikrein)基因疗法激肽释放酶是体内的一类蛋白酶,可使底物激肽原分解为缓激肽。缓激肽具有舒张血管活性,可参与对血压和局部组织血流的调节。在人体和动物实验中证实,缓激肽是目前已知的最强的舒血管物质之一。Eric等给予高血压大鼠模型静脉注射以腺病毒为载体的人组织激肽释放酶基因后，延迟BP升高时间达2d,并且降压作用持续约23d。注射人组织激肽释放酶基因的大鼠的最大降压幅度可达50mmHg(1mmHg=0.133kPa),最小降压幅度也可达32mmHg。EricD,HideakiY,ChaoJL,etal.Adenovirus􀀁mediatedkallikreingenedeliveryhypertensionandprotectsagainstrenalinjuryindeoxy-coritcosteronesaltrats[J].Immunopharmacology,1999,44(1-2):57.2.肾上腺髓质素(adrenomedulin,ADM)基因疗法人类的肾上腺髓质素由52个氨基酸组成,在体内具有舒张血管、促尿钠排泄和强心等作用。Wei等将双链腺相关病毒为载体的人ADMcDNA通过尾静脉注射入成年SHR,两周后收缩压明显下降,此作用持续时间长达16周。左室肥厚和心肌纤维化、肾小球硬化、肾小管损害程度均明显降低。WeiX,ZhaoC,JiangJ,etal.Adrenomedullingenedeliveryalleviateshypertensionanditssecondaryinjuriesofcardiovascularsystem[J].HumGeneTher,2005,16:372􀀁380.3.心房利尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)基因疗法ANP主要是由心房肌细胞合成和释放,通过舒张血管,