TLC板技术经验交流

TLC薄层层析技术Thin-LayerChromatography2一、TLC简介二、操作过程三、扩展及用途四、问题讨论主要内容：背景：薄层色谱法(Thin-LayerChromatography,简称TLC）是Kirchner等人在五十年代从经典柱色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种色谱技术。六十年代后，Stahl等人对薄层色谱法的标准化、规格化及扩大应用等方面进行了许多工作，使该法日趋成熟。2010年版中国药典一部有3341项鉴别采用TLC法分类：按薄层色谱使用的固定相的性质及其分离机制可分为吸附薄层、分配薄层、离子交换薄层及分子排阻薄层背景和分类4原理:利用吸附剂(硅胶)对样品中各组分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各组分达到分离的目的。特点：微量、快速、简单、节省一般认为TLC是一种定性和半定量的方法原理和特点5点样薄层板预处理展开展开剂选择显色显色剂使用定位定量和定性操作过程氧化铝有弱碱性pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三种氧化铝。弱碱性氧化铝用来分离中性或碱性化合物；中性氧化铝适用于酸性及对碱不稳定的化合物的分离；酸性化合物可用酸性氧化铝分离。硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶等化学键合固定相（C18、C8等）薄层板硅胶表面带硅醇基（－Si－OH），呈弱酸性(pH=4.5)，活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚类、有机酸、醛类、甾体化合物以及氨基酸类，是基于吸附作用；非活性硅胶含有一定的水，在分离色素时是基于分配作用。硅胶G:是含有13％煅石膏（gypsum）黏合剂的硅胶硅胶H：不含黏合剂的硅胶硅胶HF254：不含黏合剂，含有一种无机荧光剂（如锰激活的硅酸锌），在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光硅胶GF254：含有煅石膏黏合剂，含荧光剂，在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光硅胶HF254+366：不含粘合剂，在254与366nm波长有荧光硅胶PF254：制备型的，在254nm有荧光（有荧光剂，适用于不发光不易显色物质的制备与分离）市售预制板规格将吸附剂或载体均匀涂布在玻璃板、塑料片或铝箔上的预制板。薄层有软板及硬板两种。硬板系在吸附剂中加入适量粘合剂后用湿法涂层，粘合剂的加入可以增加薄层的强度。常用的粘合剂为羧甲基纤维素钠(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般应于110℃下活化30min薄层厚度约为0.2-0.3mm。制备板0.5-2mm。薄层的制备手动点样：灵活方便，常用于各种TLC鉴别中。自动点样重现性和准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。半自动点样仪点样量：原点位置的负荷有限，体积0.5～10微升，浓度通常为0.5～2mg。直径3mm以内样品溶剂：原则上应选择对可以溶解但溶解度不是很大的溶剂一定要有交叉点点样Spyringe10Note:a.点样的浓度要控制适当；b.点的斑点较小，展开的TLC分离度好c.0.3mm毛细点有机相，0.5mm点水相。毛细管取样1cm？3.14*（0.3mm/2）²*10mm=1.413mm³=0.71μL3.14*（0.5mm/2）²*10mm=3.925mm³=1.96μL点样常见问题1、点样量太多。展开剂不能全部负载2、太浓了。展开剂从原点外围绕行3、浓。未分开4、样品溶剂残留。吹干时应注意高温破坏样品5、点样量太少。看不清6、样品溶剂中溶解度很大。原点将变成空心圆12一般极性溶剂体系(CH2Cl2,THF,ethylacetate,etc)强极性溶剂体系(DMSO,DMF)需要淬灭的体系(NaH,LiAlH4,n-BuLi,etc)强碱、酸性物质(NaOH,H2SO4,etc)一般不推荐直接取样，建议淬灭后简单后处理再取样，或稀释后取样。最好简单后处理（加水和有机溶剂萃取）以后取样处理（如加水或酸和有机溶剂）后取样最好中和后取样Note:a.产品在水相or有机相；b.有无没溶解的固体。反应液的取样：展开方法展开剂浸入薄层下端高度不应超过0.5cm，当心将样品带被展开剂浸泡硬板可以进行近水平、上行、下行、双向、多次展开等展开槽有直立式、平卧式、双槽式、夹心式或水平式Note：a.展开槽应密闭。溶剂蒸气、液相(展开剂)、固定相(吸附剂)一起构成复杂的三维层析过程b.展缸预先饱和以减弱边缘效应，如果薄层板也同时预饱和效果更佳。c.点样带宽时（常见制备板）。先用大极性溶剂展2cm以浓集样品，干燥薄层板，再用所需展开剂展开。①使各成分间有较好的分离;②Rf在0.2～0.8为有效;监控点应在0.4~0.6之间③不与待测组分发生化学反应;④沸点适中，黏度较小；⑤展开后组分斑点圆且集中；⑥混合溶剂最好新鲜配制;展开剂的选择原则16展开方向有单向、单向长板、多次、多种极性展开等.展一次展多次第一次展开PE/EA=4:1第二次展开CH2Cl2/MeOH=10:1采用多次展开的方法可以提高TLC的分离效果。做一次检测得到较多的样品信息，展开前多思考。17展开机理的探讨ABCD为硅胶层，EFCDG为展开剂，EF为展开剂前沿，CDG为展开剂水平面。展开剂以硅胶胶表面ED为界分ABCDEFG展开方向毛细层（EFCD）内的展开剂理所当然向AB方向运动依附层（EDG）的展开剂作为额外的补充源泉同一瞬间，跨过薄层板上任一点展开剂的绝对量彼此相等，但由于液层厚度不同，必然存在速度差异所以，Rf值越大，斑点也就越大。碱性物质能与硅胶作用，易被吸附出现脱尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等避免先低后高，先单一后复杂，酸加酸，碱加碱，羰基加丙酮，相似相容原则展开剂的选择方法石油醚二氯甲烷乙醚四氢呋喃乙酸乙酯丙酮正丙醇甲醇水常用展开剂极性顺序三角形法（a）适于吸附薄层;(b)适于分配薄层.（a）苯点滴实验法最合适的展开剂？Note：a.展开剂浑浊不清，应分液澄清后b.正丁醇和丙醇对斑点扩散影响较小c.丙酮可混溶溶剂，降低剂粘度，加快展速d.由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。大展开剂:ArOH(aqsat.)、n-BuOH(aqsat.)、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1)常用展开剂对：E/P、M/D、PE/Acetone、THF/PE、MeOH/Toluene、DCM/PEnBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP单磷酸及3,5-双磷酸n-BOH/HOAc/H2O=5/1/1巯基乙胺及甲基化后DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨胆酸THF/PE=2/3ED-71中间体AsMg、FPM中间体硫醚，亚砜、砜24显色一看、首先在日光下观察，划出有色物质的斑点位置二照、在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点三碘、多数有机物吸附碘可逆的产生棕色或黄色斑点四显、既无色又无紫外吸收的物质，可以用显色剂显色DIEAPE/EA=1:2NEt325各种常用显色剂及其配制方法:硫酸溶液硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液与0.5-1.5mol／L硫酸铵溶液大部分化合物高锰酸钾1.5gKMnO4+10gK2CO3+1.25mL10%NaOH+200mL含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛磷钼酸(PMA)乙醇5％磷钼酸乙醇溶液喷后120℃（可用加热枪）缓慢烘烤还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。茚三酮O.2g溶于乙醇l00ml中。方法：喷后于110oC加热。醋酸呈红紫色斑点氨基酸或胺基溴甲酚绿溴甲酚绿0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml酸或碱26续表茴香醛溶液674mL乙醇+18.5mL茴香醛+25mL浓硫酸浸泡后吹干再加热氰基、胺基及硝基2,4-二硝基苯肼2g2,4-二硝基苯肼+60mL浓硫酸+80mL水+200mL乙醇酮一般显黄色，饱和醛则显红色或砖红色不定羰基的化合物吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。喷洒试剂后，100～110℃加热l0min，显蓝、红、桃红或棕色斑点氨基酸、多肽香草醛/硫酸香草醛1g溶于硫酸lOOml。喷后于120℃加热至呈色最深。高级醇、酚、甾类及精油定性影响Rf值的因素较多：温度、湿度。一般在较高温度下展开时，Rf值较高，反之降低需经过两种以上不同组成的展开剂得到的Rf值与标准品一致时，才可认定该斑点与标准品是同一化合物；通过斑点颜色，有无紫外吸收或产生萤光的颜色，以及用专属性显色剂后斑点显色的情况与标准品对照可帮助鉴定手性薄层色谱一、手性选择剂混合制板（较难实现）二、手性选择剂添至流动相中，作展开剂使用三、？好的分析方法应该是简单的，简洁是一种美。手性薄层色谱分离的因素手性选择剂的种类、纯度、浓度大小、与吸附剂的比例化合物消旋化，配置成溶液后这种趋势变得更大。Nature1965208,p71-72nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomernBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer31纯度?状态?合理?可行?TLC用途32监测反应进程:反应有无新点产生原料有无剩余，剩余多少反应是否干净综合判断反应如何处理Note：a.点样量b.检测时间c.留样对照d.重要板留存33反应物加完应立即检测；反应中出现变化（温度，颜色，气体、沉淀）立即检测反应物加完后半小时内应检测，然后适时跟踪检测快速反应的体系（如硝化、还原），在短时间内需要检测过夜反应，过夜前后应检测检测时机34极性增大:NO2NH2RNH-Bn(Boc,Cbz)RNH2X-NH、CNR-S-R’R-SO-R’CHO（R-X）CH2OHCO2H官能团转化极性大极性小极性相近的：R=RR-RCHOC=C极性减小:OHX(Cl,Br,I)COOHCO2R,R-SO-R’R-SO2-R’-NH2(-OH)NH-R,(OH-R,)35TLC组合判断TLC-HPLC/LC-Ms联用（定性和定量）TLC-MS联用(适用于拿标样点）TLC-NMR联用（确认结构）TLCMSNMRLCMs/HPLC36后处理情况EAH2O固体的纯度和母液的取舍SolidMothersolutionsolidmothersolutionaq.org.萃取是否有效37摸索柱层析洗脱条件Note:Rf值在0.2左右的展开剂比例为洗脱剂的合适值过柱时组分流出顺序未必和TLC上点极性顺序一致Rf=0.2Desiredproduct梯度洗脱39制备TLC展开刮板洗脱点板显色40制备TLCNote:1溶剂:极性小,溶解性好，易挥发2上样量:40-60mg3上样的位置:距离两端大约1cm,距离底边大约2cm.Note:上样时如果上的色带太宽或不齐可用大极性溶剂预展开2~3cm41TLC常见问题1.两个点离的太近怎么办？2.如果有酸碱基团我们需要如何处理？3.有强酸或者强碱的反应体系TLC跟踪反应需注意那些方面，同理有固体或者两相反应时如何处理？4.TLC爬板为什么有时会爬歪?5.如何提高TLC效率？6.板展开后，溶剂前沿的点是一个点吗？原点上的点是一个点吗？42