分子荧光和磷光光谱

Molecularluminescenceanalysis中南民族大学2014.春分子发光分析内容(contents)原理分子荧光与磷光产生过程激发光谱与荧光光谱荧光的产生与分子结构关系影响荧光强度的因素仪器应用发光现象起因是吸收了外在提供的能量引起的外在的能量热电光化学能荧光入射光荧光1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语.萤石纯净的萤石为无色，但因含有较多Y、Ce等元素，造成萤石结构空位，产生色心而致色，常见的颜色有浅绿色至深绿色，蓝、绿蓝、黄、酒黄、紫、紫罗兰色、灰、褐、玫瑰红、深红等。2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。绿色荧光蛋白GFP绿色荧光蛋白GFP原理GenerationofMolecularFluorescenceandPhosphorescence荧光和磷光的产生过程分子能级和跃迁电子能级、振动能级和转动能级基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；荧光和磷光的产生过程电子激发态的多重度单重态S三重态T大多数有机分子的基态处于单重态三重态能级比相应单重态能级低S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；能级图S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为l‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l‘2l2l1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。激发光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；荧光（磷光）光谱固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。光谱例子200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱激发光谱和发射光谱关系Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。镜像规则200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱分子产生荧光的条件分子产生荧光必须具备的条件具有合适的结构（强的紫外可见吸收）具有一定的荧光量子产率荧光量子产率（）吸收的光量子数发射的光量子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射化合物的结构和荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。荧光和取代基长共轭结构共轭系统↑→f↑→lex、lem↑取代基供电子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN→f↑，F↑吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X→f↓，F↓，甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+→对f无影响影响荧光的外部效应1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；极性↑→f↑→F↑→l↑粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓形成氢键→S1*(V=0)分子↓→F↓影响荧光的外部效应2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；NH3+NH-NH2OH-OH-H+H+pH2pH7~12pH13兰色荧光影响荧光的外部效应4.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；影响荧光的外部效应5.溶液荧光的猝灭碰撞猝灭:荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量1g~1mg/ml)荧光熄灭剂(quenchingmedium)：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。仪器Instruments仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(l)和固定能量差及可变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的l可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但l15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；l60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路光源仪器校正吸收池入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？检测下限：0.1～0.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。定量依据与方法(1)定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3I0lc=Kc定量依据与方法（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；多组分混合物的荧光分析(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定•可分别在各自的l荧波长处测定,求出它们的含量(2)如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;•可选用不同的激发光进行测定多组分混合物的荧光分析激发光谱和发射光谱都互相干扰利用荧光强度的加和性（If=If1+If2+If3+…），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧CTlex=385nmlem=435nm吡啶硫胺荧CPlex=410nmlem=480nm相互干扰荧光光谱重叠在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度,或410nm下激发在435和480nm下分别测荧光强度,42在385nm下激发，在435和480nm下分别测荧光强度If=Kc——K:纯物质在选定波长下测If,求K或410nm激发，在435和480nm下分别测荧光强度If435/385=26339104cT+210104cPIf480/385=9685104cT+1022104cPIf480/410=2816104cT+1709104cPIf435/410=6419104cT+252104cP硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法。为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定。维生素B2•——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。•在低浓度情况下，I=Kc，I与c呈线性关系。•在lex光照射下，发出绿色荧光，lem=525nm下测I，用标准曲线法测定。CHHOHOHONNNNHCHCHCHOHCH22OOHCHC33缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎3，4–苯并芘的测定3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–苯并芘，汽车尾气也是主要来源。食品加工过程也会产生3，4–苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品。分析测定：用环