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实验四X染色质标本制备及观察一、实验目的1.掌握X染色质标本的制备方法。2.熟悉人体X染色质标本的制备原理和临床意义。3.了解X染色质的形态特征。二、实验用品人体口腔颊部黏膜上皮细胞、光镜、载玻片、盖玻片、牙签、吸水纸、擦镜纸；试剂：固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、乙醇（70%、95%、100%）5M的HCl溶液、香柏油、二甲苯、0.2%甲苯胺兰染色液。三、实验原理X染色质又称X小体或Barr小体，是女性细胞分裂间期核内的一种特有染色质。X染色质位于核膜边缘，一般呈三角形、半圆形或扁平形等，为异固缩小体。正常女性间期核X染色质出现率为10％～59％，数目为X染色体的数目减1。这一结构在口腔、阴道等部位的粘膜上皮中通过简单的染色方法就可以观察到。通过进一步计算X染色质阳性率，不仅可以在胚胎期较为准确的判断胎儿性别；当临床上怀疑有X染色体数目异常时，也可以作为辅助诊断方法，对于没有条件开展染色体检查的地区不失为一种经济实用的方案。5X染色质（X-chromatin）正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深，约为1微米大小的椭圆形小体，既X染色质。6正常女性有两条X染色体，男性只有一条X染色体（和一条Y），X染色体有数量差异。那么，位于X染色体上的基因产物是否存在差异昵？为什么只有女性才有X染色质而男性没有？为什么某一种X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？Lyon假说，来解释上述问题。7莱昂（Lyon）假说X失活发生在胚胎生命早期失活是随机的失活是完全的失活是永久的和克隆式繁殖的也就是说在女性细胞中的两条X染色体只有一条有活性，另一条无转录活性，在间期细胞核异固缩而失活。这样男女X连锁基因产物量保持相同水平，这种效应称为剂量补偿。8需要说明的问题1）如果一个有缺失的X染色体，优先失活；2）常染色体和X染色体平衡易位的个体中，正常的X染色体优先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，约1/3的gene逃避失活，已知16个基因逃避失活；4）体细胞X失活是永久的，但在生殖细胞发育中，失活是可逆的；5）C中只有一条X染色体有活性，其他均以失活状态存在；四、实验方法受检者漱口后，用牙签刮取口腔粘膜上皮细胞，均匀涂在干净的载玻片上（约一张盖玻片大小），用记号笔标记细胞面，不等涂布干燥，立即放入3：1甲醇—冰醋酸固定液中，固定15分钟后取出玻片标本置于5MHCl中，水解15min，充分冲洗，除去多余的盐酸，0.2％甲苯胺蓝染液染色5min，分别置于70%、95%及无水乙醇中做脱水处理，晾干后镜检。五、结果与分析1.由于处于核膜内侧的X染色质在压片时可能被压在核的中央，这种情形下，X染色质容易与核中其它的着色的结构相混。为避免临床检测的误诊，计算X染色质时，只选择位于核膜内侧边缘、为核内唯一轮廓清楚的半圆形或三角形浓染小体。2.从理论上讲，正常女性的间期细胞中都应该有一个X染色质，但事实上由于染色方法、染色技术以及X染色质在细胞核中的位置不同，实际检查中不可能在每个细胞中都看到。六、作业1．画2～3个典型细胞，示X小体的形态和所处部位。