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1动物疫病采样,保存及送样技术湖北省动物疫病预防控制中心宋念华2008.72动物疫病采样,保存及送样技术湖北省动物疫病预防控制中心宋念华2008.73随着畜牧业的发展,科技进步以及国际贸易的日益频繁，动物传染病也在发生变化。湖北动物疫病控制中心有些传染病临床症状和剖检变化越来越不典型；有些传染病的临床症状和剖检变化比较相似；有的传染病也不能仅凭特征性病变确诊。4同时由于人们观念的转变，衡量免疫状况，制定合理免疫程序,进行疫病监控,掌握疫病动态等都要根据监测数据来确定。兽医实验室的工作显得越来越重要。而在动物疫病诊断、监测中，采样方法、采样部位、采样数量和样品质量直接决定诊断监测结果的准确性和监测结论的科学性。因此，对采样人员采样方法、技术都有特定的要求。湖北动物疫病控制中心5主要内容采样一般原则采样器械物品的准备实验采样时机、部位和数量采样方法采样时注意事项采样实例运输保存采样和运输过程中生物安全湖北动物疫病控制中心6采样一般原则（1）1.凡是血液凝固不良,鼻孔流血的病,死动物，应耳尖采血涂片，首先排除炭疽，炭疽病死的动物严禁剖检。2.采样时应从胸腔到腹腔，先采实质器官做到无菌，避免外源性的污染，最后采污染的组织，如胃肠组织、粪便等。3.采取的病料必须有代表性，采取的组织器官应病变部位明显。采取病料时应根据不同的疫病或检验目的，采其相应血样、活体组织、脏器、肠内容物、分泌物、排泄物或其他材料。病因不明时，应系统采集病料。湖北动物疫病控制中心7采样一般原则（2）4.病料应在使用治疗药物前采取，用药后会影响病料中微生物的检出。死亡动物的内脏病料采取，最迟不超过死后6小时(尤其在夏季)，否则，尸体腐败，难以采到合格的病料。5.血液样品在采集前一般禁食8小时。采集血样时，应根据采样对象、检验目的及所需血量确定采血方法与采血部位。6.采样时应对环境的影响，防止污染环境和疫病传播，做好环境消毒和废弃物的处理，同时做好个人防护，预防人畜共患病感染。湖北动物疫病控制中心8采样器械物品的准备（1）（一）器械1.采样箱、保温箱或保温瓶、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、碘酒棉、一次性注射器等。2.样品容器包括小瓶、玻片、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等。3.试管架、铝盒、瓶塞、无菌棉拭子、胶布、封口膜、封条、冰袋等。4.个人防护用品口罩、防护镜、一次性防护服、手套、鞋套、帽子等注意：采样刀剪等器具和样品容器须无菌。湖北动物疫病控制中心9采样器械物品的准备（2）（二）采样记录用品不干胶标签、签字笔、记号笔、采样单等。（三）保存液阿氏液(A1severs)、30％甘油盐水缓冲液、肉汤、PBS液、双抗。湖北动物疫病控制中心10采样时机和数量根据实验目的采取不同的样本类型，如组织、血清等；送检的样本数应满足送检目的的需要；采集的样本应具有一定的代表性。1.诊断时样本最好发病初期（未用药），临床症状明显期采集5只(头)以上病死和发病动物的有病变的器官组织、血清和抗凝血各10份。湖北动物疫病控制中心11采样时机和数量2.免疫效果监测时动物免疫后14-20天，随机采集同群动物血清样品30份。3.疫情监测或流行病学调查时采集血清、各种拭子、体液、粪尿或皮毛样品等，采样数量可根据动物年龄、季节、周边疫情情况估算其感染率，然后计算应采样品数量。湖北动物疫病控制中心12采集方法及技术要求湖北动物疫病控制中心13禽的采样方法1.翅静脉采血：在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向翅静脉丛刺入，见有血液回流，即把针芯向外拉使血液流入采血针。采血完毕用干棉球按压止血。湖北动物疫病控制中心2.家禽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法取无菌棉签，插入鸡喉头内或泄殖腔转动3圈，取出，插入离心管中(双抗PBS)，盖紧瓶盖，做好标记。密封低温保存。14禽的采样方法湖北动物疫病控制中心3.羽毛采集方法拔取受检鸡含羽髓丰满的翅羽或身上其他部位大羽，将含有羽髓的羽根部分按编号分别剪下收集于小试管内，于每管内滴加蒸馏水2～3滴(羽髓丰满时也可不加)，用玻璃棒将羽根挤压于试管底，使羽髓浸出液流至管口，用滴管将其吸出。15猪的采血方法1.耳缘静脉采血2.前腔静脉采血(1)站立保定：保定器保定让猪头仰起，露出右腋窝，从右侧向心脏方向刺人，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针。(2)仰卧保定：把前肢向后方拉直。一般用装有20号针头的注射器采血，其穿刺部位在胸骨端与耳基部连线上胸骨端旁开2厘米的凹陷处，向后内方与地面呈60度角。角刺入2～3厘米，当进入约2厘米时可一边刺入一边回抽针管内芯；刺人血管时即可见血进入针管内，采血完毕，局部消毒。湖北动物疫病控制中心16猪活体的样品采集1.扁桃体采取方法从活体采取扁桃体样品时，应使用专用扁桃体采集器：先用开口器开口，可以看到突起的扁桃体，把采样钩放在扁桃体上，快速扣动扳机取出扁桃体放离心管中，冷藏送检。2.鼻腔拭子、咽拭子采集方法应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉的分泌物，蘸取分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1毫升。湖北动物疫病控制中心17猪活体的样品采集3.肛拭子采集方法用灭菌棉拭子插入肛门或泄殖腔内采集其内容物和分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1毫升。湖北动物疫病控制中心18牛、羊采血方法牛、羊颈静脉采血将动物保定，稍抬头颈，于颈静脉沟上1／3与中1／3交界部剪毛消毒，一手拇指按压采血部位下方颈静脉沟血管，促使颈静脉怒张，另一手执针头，与皮肤呈45度角。角由下向上方刺入，血液顺器壁流人容器内，防止气泡产生。待血量达到要求后，拔下针头，用消毒棉球按压针眼，轻按止血。湖北动物疫病控制中心19脓汁做病原菌检验的，应在药物未治疗前采取。采集已破口脓灶脓汁，宜用棉拭子蘸取，剪去露出部分，盖紧瓶盖，做好标记；未破口脓灶，用注射器抽取脓汁，密封低温保存。湖北动物疫病控制中心20乳汁乳房先用消毒药水洗净(取乳者的手亦应事先消毒)，并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的3～4把乳汁弃去，然后再采集10毫升左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。湖北动物疫病控制中心21粪便样品的采集（1）1.用于病毒检验样品分离病毒的粪便必须新鲜。少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，并立即投入灭菌的试管内密封，或在试管内加入少量pH7.4的保护液再密封；须采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用器械或用戴上胶手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，经密封并贴上标签，立即冷藏或冷冻送实验室。湖北动物疫病控制中心22粪便样品的采集（2）2.用于细菌检验的粪便样品采集做细菌检验的粪便，最好是在动物使用抗菌药物之前，从直肠或泄殖腔内采集新鲜粪便。采样方法与供病毒检验的方法相同。粪便样品较少时，可投入无菌缓冲盐水或肉汤试管内；较多量的粪便则可装入灭菌容器内，贴上标签后冷藏送实验室。湖北动物疫病控制中心23粪便样品的采集（3）3.用于寄生虫检验的粪便样品采集粪便样品应选自新排出的粪便或直接从直肠内采得，以保持虫体或虫体节片及虫卵的固有形态，一般寄生虫检验所用粪便量较多，需采取5～19克新鲜粪便，大家畜一般不少于60克，并应从粪便的内外各层采取。粪便样品以冷藏不冻结状态保存。湖北动物疫病控制中心24采样注意事项（1）采集前应准备好经消毒的器械和容器。死因不明的动物尸体，在解剖前，必须做血液涂片，染色镜检，排除炭疽后方能解剖取样。病料的采取，须于动物死后6小时以内进行。采样时必须做到无菌操作采取，病料要尽可能齐全，除了内脏、血清、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织。尽快冷冻保存。湖北动物疫病控制中心注意事项25采样注意事项（2）天气炎热或不能马上送检的用作细菌检验的材料，可用30%甘油缓冲盐水保存；作病毒检验的材料，可用50%甘油缓冲盐水保存，并做到低温保存传递。注意个人卫生防护，在采样中必须穿戴工作服和手套。采样后要及时对尸体进行无害化处理，被污染的场地进行彻底消毒。湖北动物疫病控制中心注意事项26采样实例湖北动物疫病控制中心27口蹄疫采样（1）样品的选择用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的水泡皮和水泡液为最好。样品的采集和保存样品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭)，剪取病畜的新鲜水泡皮3—5克放入灭菌小瓶中，加适量50％甘油／磷酸盐缓冲液(pH7.4)，加盖密封；也可采用无菌器具采集水泡液至少1毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封。尽快冷冻保存。湖北动物疫病控制中心28口蹄疫采样（2）血清样品在发病和扑杀时均应无菌操作采集10份以上的血清，每头血清不少于1mL。无菌分离血清装入1.5mL离心管中，加盖密封后冷藏保存，通过检测抗体，做出追溯性诊断。湖北动物疫病控制中心29口蹄疫采样（3）牛、羊O-P液(咽食道分泌物)的采集方法被检动物在采样前禁食(可饮少量水)12小时，以免胃内容物反流污染O-P液。采样探杯在使用前经装有0.2％柠檬酸或2％氢氧化钠溶液的塑料桶中浸泡5分钟，再用与动物体温一致的清水冲洗探杯后使用，每采完一头动物，探杯要重复进行消毒并充分清洗。湖北动物疫病控制中心30口蹄疫采样（4）牛、羊O-P液(咽食道分泌物)的采集方法采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送人食道上部10～15厘米处，轻轻来回抽动2～3次，然后将探杯拉出。取出8～10毫升O-P液，倒入含有等量细胞培养液(0.5％水解乳蛋白-Earle液)或磷酸缓冲液(0.04摩／升、pH7.4)的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口，放冷藏箱及时送检，未能及时送检应置于-30℃冷冻保存。湖北动物疫病控制中心31禽流感采样（1）组织样品应采集组织样品。取死亡不久的5只病死禽采样，病死禽数不足5只时，取发病禽补齐5只。每只禽采集肠管及肠内容物1份；肺和气管样品1份；肝、脾、肾、脑等各1份并分别采集。上述每个样品取样重量为15g-20g，放于样品袋或平皿中，如果重量不够可取全部脏器（如脾脏）。不同禽只脏器不能混样，同一禽只不同脏器不应混样。湖北动物疫病控制中心32禽流感采样（2)拭子样品取5只病禽采样，每只采集泄殖腔拭子和喉气管拭子各1个，将样品端剪下分别置于含有抗生素PBS的（加1.0mL-1.3mLPBS）小塑料离心管中，封好口，贴好标签。喉气管拭子采集方法：将棉拭子插入口腔至咽的后部直达喉气管，轻轻擦拭并慢慢旋转，沾上气管分泌物。泄殖腔拭子采集方法：将棉拭子插入泄殖腔约1.5-2cm,旋转后沾上粪便。湖北动物疫病控制中心33禽流感采样(3）粪便样品小珍禽采泄殖腔拭子容易造成伤害，可只采集5个新鲜粪便样品（每个样品1g-2g），置于内含有抗生素PBS（加1mL-1.5mLPBS）的离心管中，封好口，贴好标签。保存粪便和泄殖腔拭子的PBS中抗生素浓度提高5倍。湖北动物疫病控制中心34禽流感采样（4）血清样品采集10只病禽的血样，心脏或翅静脉采血，每只病禽采血样2mL-3mL，盛于西林瓶中或10mL离心管中，经离心或自然放置析出血清后，将血清移到1.5ml小塑料离心管中，盖紧瓶塞，封好口，贴好标签。不同禽只的血样不能混合。湖北动物疫病控制中心35高致病性猪兰耳病采样实质脏器样品：无菌采集濒死猪扁桃体、肺、脑、心、肝、脾、肾、淋巴结及其他可见病变的组织10-20克以上，放入无菌容器内。每块组织最好单独放在1个容器内（也可置于自封袋中），用记号笔注明日期、组织脏器和动物名称。注意防止组织间相互污染，及时置于低温条件下保存。血清样品：采集的血液2-5mL，在室温下静置2h-4h（防止曝晒），待血液凝固后分离血清。若需长时间保存，则将血清置-20℃以下保存，但要尽量避免反复冻融。胚胎样本：选取完整、无腐败的胚胎送检动物主要疫病病原监测取样样品.doc湖北动物疫病控制中心36做好样本记录样品记录应伴随样品送到实验室，且应包括以下内容