外显子捕获

外显子捕获外显子是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。在人类基因中大约有180,000个外显子，占人类基因组的1%，约30MB。人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略，外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。对肿瘤基因突变检测具有显著意义，因为外显子测序容易提高深度，可以轻易达到100X、200X。而因为外显子捕获是有偶然性的，对小片段结构变异、拷贝数变异很难检测。外显子测序简介目前市场主要外显子捕获试剂盒SeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0（Roche）SureSelectXTHumanAllExonV6（Agilent）TruSeqExomeLibraryPrepKit（Illumina）TruSeqRapidExomeLibraryPrepKit（Illumina）Roche罗氏2008年推出NimbleGen序列捕获2.1M外显子组芯片，随之在2009年底推出的EZ外显子组序列捕获能提供液相的工作流程并以DNA液相探针杂交来捕获目的片段。SeqCapEZHumanExomeLibrary使用高密度探针的方法，主要是利用杂交和DNA微阵列技术基因分离原理来捕获目标区域。产物可以覆盖20000个以上的基因，超过二百万个DNA寡核苷酸探针捕获目标区域，覆盖区域的总大小可以达到64Mb，编码区覆盖度达到97%以上，而且检测灵敏度较高。KAPALibraryPrepKitSeqCapPureCaptureBeadKitSeqCapAdapterKit(Aand/orB)KAPAHiFiHotStartReadyMixSeqCapHybridizationandWashKitDNACovaris打断仪DNA真空浓缩仪金属浴片段大小：180－220bp测序平台：IlluminaGenomeAnalyzerII、HiSeq或MiSeq测序仪实验周期：2天AgilentSureSelectXTHumanAllExonV61SureSelectLibraryPrepKit.2SureSelectTargetEnrichmentKitIndexingHybModuleBox#23HerculaseIIFusionDNAPolymerase4SureSelectTargetEnrichmentKitBox#1片段大小：150-200bp测序平台：IlluminaHiSeq、MiSeq实验周期：2天illuminaIllumina,TruSeqExomeEnrichmentKit是近年来刚推出的一种溶液型的序列捕获方法，利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显子区域。通过与目标区域特异的生物素标记DNA探针杂交，富集目标区域，富集的DNA片段随后从磁珠上洗脱，并杂交进行第二次富集反应，从而提高目的片段捕获的特异性。而且较其他产品，illumina外显子捕获试剂盒价格更低。TruSeqExomeLibraryPrepKit片段大小：150bp实验周期：2.5天TruSeqRapidExomeLibraryPrepKit优势：试剂盒包含所有流程反应试剂，周期缩短至1.5天外显子疾病检测四种测序试剂盒比较ENSEMBL、RefSeq：RNAdatabasesCCDS：protein-codingdatabasesUTRs：非编码区illumina外显子捕获试剂盒可以捕获大量UTRs序列，是其它试剂盒不具备的。Agilent试剂盒捕获的数据更为集中数据的有效性A：平均读136.8million数据，匹配数据占97.4%、97.7%、97.6%、98.95%筛选后有效数据占54.8%、66.0%、71.7%、40.1%B：无效读数包括：非目标区域、PCR复制出来的相同分子、同一区域重复、错配随机选取50million数据进行分析产物覆盖率Nimblegen、Agilent、Truseq、NexteraA：用个产品本身设计的目标区域96.5%、99.8%、96.9%、98.2%B：四种试剂盒所共享的数据区域98%、99.8%、98.8%、99.5%技术重复性都很好在不同测序深度条件下进行5-50million数据覆盖率分析总体而言，Agilent覆盖率最高Truseq和Nimblegen相似Nextera最差产物GC含量检测随测序深度增加，高GC含量的数据都显著降低除了Nextera，主要原因是转座酶打断的应用。SNP检测产物总变异数检测：Nimblegen大于Illumina大于Agilent共同目标区域变异检测：Aglient大于illumina大于Nimblegen非编码区变异检测：Illumina大于Nimblegen大于AgilentSNP与目标区域大小有关Indels检测产物总变异数检测：Truseq大于Nimblegen大于Nexera大于Agilent共同目标区域变异检测：Aglient大于illumina大于Nimblegen非编码区变异检测：Illumina大于Nimblegen大于Agilent综合评价:从目标数据广度上来说，illumina含有更多UTRs、RefSeq、CCDS以及Ensembl外显子数据，其次是NimbleGen和Agilent.从产物捕获效率上来说，Agilent大于NimbleGen大于illumina从产物覆盖度上来说，Agilent大于NimbleGen大于illumina从GC含量分析，illuminaNextera试剂盒效果较差从SNP变异检测性能分析，NimbleGen大于illumina大于Agilent，结果与目标产物大小有关需要根据研究目的具体选择试剂盒进行试验