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标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第1页起草人审核人批准人起草日期审核日期批准日期起草部门质量管理部颁发部门办公室生效日期一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8.附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌药用原料及辅料103102**未做统一规定。1.1成品微生物限度标准品名法定标准内控标准需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌大肠埃希菌沙门菌大肠埃希菌沙门菌乳糖≤1000≤100—无≤100≤50——无水乳糖≤100≤10—/10g—/100g≤100≤10—/10g—/100g蔗糖无无无无≤100≤50——(1)．“—”为不得检出。(2)．目测霉变者以不合格论。(3)．“无”为标准依据或无相应规定。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第2页1.2工艺用水微生物限度标准品名法定标准内控标准需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活饮用水≤100不得检出≤100不得检出纯化水≤lOO不得检出≤80不得检出1.3内包装材料微生物限度标准品名(单位)需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌药用聚乙烯烃塑料袋(100cm2)≤1000cfu≤100cfu—≤100cfu≤10cfu—说明：1．“—”为每100cm2中不得检出。2．目测霉变者以不合格论。3．“无”为标准依据或无相应规定。2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。生化试剂储存箱。2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第3页2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。2.4用具2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3消毒液、稀释剂、试液及培养基3.1消毒液、稀释剂及试液。3.1.10.1%苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。3.1.25%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。3.1.3．75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.4．0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。3.1.5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：供非水溶性供试品供试液制备用。3.1.6．无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。3.1.7．甲基红指示液：取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，水适量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8．V-P试液：①氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇试液：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。3.1.9．革兰染色液：①沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：取碘化钾2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第4页闭棕色瓶中储存。3.1.10．中性红指示液：取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。变色范围pH6.8~8.0（红→黄）。3.1.11．亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.0~7.6（黄→蓝）。3.1.13．酸性品红指示液：以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。优点：无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。变色范围pH6.0~7.4（红→黄）。3.1.14．曙红钠指示液：取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15．靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。3.2培养基3.2.1．培养基的制备及储存3,2,1,1溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10~15分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。3.2.1.3校正酸碱度：培养基必须有适当的pH值。测定pH值是培养基配制过程中的重要步骤之一，干燥培养基一般已校正过pH值，用时也必须再验证。pH值测定时，一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正。一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的pH值高0.2左右，灭菌后基本合适。调整pH值后要加热过滤，使培养基澄清。3.2.2培养基的分装：3.2.2.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。3.2.2.2固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。平皿：如倾注平皿，应在无菌室中放置3～4小时，如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～60分钟。水蒸气会自然蒸发。斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积的1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。3.2.3培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。普通培养基多采用121℃、103.42kPa灭菌15分钟，但容器和装量较大时，可延长至20分钟。高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全杀灭微生物的目的。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第5页3.2.4培养基的储存：保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的程度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基的性质不同，不可能固定一个保存期限。制备好的平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内，4℃保存，可延长使用期限。微量生化反应管熔封于细玻管内，室温下可保存1年左右。3.3注意事项：3.3.1采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂的用量。试剂规格要求应为化学纯（CP）以上规格，其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的抑制物。3.3.2配制的培养基不应该有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。3.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。3.3.4配制培养基的pH值测定时，其波动范围应在规定的pH±0.2之内，还需注意高压灭菌后的pH值变化。3.3.5每批培养基均应有配制记录，包括名称、配制量（各种成分用量）、配制者、校对者、配制日期以及性能和无菌试验。3.3.6每批培养基在用于样品的分离鉴定之前均应作性能试验，以保证微生物检验的质量。性能试验须用已知标准菌株进行预试，符合要求方可应用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松紧应适宜，过松易污染杂菌，过紧影响透气性；每次用后需高压灭菌并随即烘干，要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换。3.3.8各种试管应先配上合适的棉塞，待高压灭菌后再分装培养基，可防止污染。3.3.9培养基配制时，应先将有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、盐类和琼脂配好，经调节pH值、加