20 免疫学检测技术

免疫学检测技术1概述免疫学检测的要求特异性：Ag-Ab灵敏性：患者阳性可能性应用医学、生物学等各个领域。如：运动员兴奋剂检测、食品、药品检测、质控临床疾病的早期诊断等。检测手段手工－半自动－全自动2抗原或抗体的体外检测一、抗原抗体反应的特点(一)特异性(二)可逆性(三)可见性（比例性）(四)阶段性3抗原或抗体的体外检测二、抗原抗体反应的影响因素反应物自身因素环境因素抗原的理化性状、分子量、抗原表位种类、数目等有关。抗体的来源、特异性、亲和力及与抗原的比例关系等。电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适当浓度的电解质。温度：一般反应在37ºC水浴或孵育箱中进行。酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为PH6~8。其它：如物理振荡等。4三、抗原抗体的检测方法及原理•凝集反应•沉淀反应•免疫标记技术抗原或抗体的体外检测5（一）凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集现象，称为凝集反应。直接凝集反应间接凝集反应6直接凝集（一）凝集反应(Agglutination)细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电介质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象。玻片凝集（定性）试管凝集（定量）7间接凝集（一）凝集反应(Agglutination)将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）反应。在适当电介质参与下，出现凝集现象。包括正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。Coombs试验间接凝集抑制反应+→协同凝集8（一）沉淀反应(Precipitation)可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等）与相应抗体结合，形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。液相沉淀反应凝胶中沉淀反应免疫浊度检测自由免疫扩散定向免疫扩散自由-定向扩散单扩散双扩散对流免疫火箭电泳免疫电泳免疫固向电泳910火箭电泳：单向免疫扩散＋电泳对流免疫电泳：双向免疫扩散＋电泳11免疫电泳12免疫浊度分析技术透射免疫比浊：抗体固定，加入抗原量越多，IC形成越多，液体的吸光度越大。散射免疫比浊：激光照射液体中IC时，光线发生散射，测量散射光强度可知待测抗原量。终点散射比浊法：测免疫反应进行到一定时间时的IC的散射信号值。速率散射比浊法：测单位时间内IC形成的最快时间段散射信号值。13用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性（三）免疫标记技术酶免疫检测技术荧光免疫技术放射免疫检测技术胶体金免疫技术化学发光免疫分析技术免疫印迹法14酶免疫检测技术（三）免疫标记技术是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。酶联免疫吸附试验BAS-ELISA酶联免疫斑点试验（ELISPOT)酶免疫组化法方法15间接法(测抗体）双抗夹心法（测抗原）抗原竞争法（测抗原）IgM捕获法（测抗体）酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）E:辣根过氧化酶HRPS:底物四甲基联苯胺（TMB）/邻苯二胺16间接法双抗夹心法酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）17抗原竞争法E→+E++→→↙试验组EEEE+→+→对照组酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）18IgM捕捉法酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）19酶联免疫斑点试验（ELISAPOT）用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌特异抗体的B细胞的频数。20EEEEEE酶联免疫斑点试验（ELISAPOT）21BAS-ELISA22荧光免疫显微技术•用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC)标记抗体制成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。•方法：直接荧光法（测抗原）间接荧光法（测抗原和抗体）（三）免疫标记技术24荧光免疫显微技术25特点：灵敏性高。达pg水平。用途：常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgD、IgE等。方法：放射免疫分析免疫放射分析放射免疫检测技术（RIA）（三）免疫标记技术26放射免疫分析免疫放射分析27（三）免疫标记技术胶体金免疫技术28能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。（三）免疫标记技术免疫印迹法29一外周血单个核细胞的分离葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法免疫细胞及其功能检测30二淋巴细胞及其亚群分离•玻璃黏附法（分离单核细胞和淋巴细胞）•尼龙毛分离法（分离B细胞和T细胞）•E花结分离法(分离T细胞和B细胞）•补体细胞毒法（分离抗原阳性和阴性细胞）•免疫吸附分离法（分离CD4+T和CD8+T)•免疫磁珠法（分离T亚群）•流式细胞术等等（细胞类型和数量）免疫细胞及其功能检测31荧光染色的细胞悬液和鞘液混合↓N2压力流室（形成鞘包悬液的层流）↓喷嘴高速喷下↙↓↘光源极光束交会散射光→散射光监测器→计算机→分析处理荧光→荧光监测器↓↓获得细胞类型数量信息高频震荡器↓细胞分离提纯系统输出极向偏转板↓分析鉴别带不同电荷的不同类的细胞在电磁场中偏离↓↓收集于不同容器中流式细胞术32流式细胞仪分选技术原理示意图33磁珠分离法•将已知抗细胞表面标记(如CD4）的Ab交联于微珠，与细胞悬液反应后，微珠借Ab结合于相应细胞群或亚群表面。再将细胞悬液加于一柱内，并置磁场中，因微珠被磁场吸引，将磁珠结合的细胞与磁珠非结合细胞分开。从而获得CD4+T细胞。＋→→＋－34（一）T细胞功能测定1T细胞增殖试验①形态学观察法②3H-TdR渗入法③MTT比色法三淋巴细胞功能测定免疫细胞及其功能检测2T细胞分泌CK功能测定①生物活性测定②免疫学测定③分子生物学检测3特异性抗原皮试结核菌素试验（OT试验）前臂5U，48－72小时，红肿硬结＞5mm为阳性。皮试（+）表示有一定的细胞免疫能力。35免疫细胞及其功能检测三淋巴细胞功能测定（二）B细胞功能测定1B细胞增殖试验①形态学观察法②3H-TdR渗入法③MTT比色法2酶联免疫斑点法SRBC+待检B细胞+补体+琼脂糖液→倾注平皿→温育1-3小时3溶血空斑形成试验：检测B细胞产生抗体的能力36免疫细胞及其功能检测三淋巴细胞功能测定（三）细胞毒活性测定测具有细胞毒作用的淋巴细胞的活性。1乳酸脱氢酶释放法251Cr释放法3凋亡细胞检测法37免疫细胞及其功能检测四吞噬细胞功能测定1中性粒细胞趋化功能测定1）滤膜渗透法2）琼脂糖平板法2中性粒细胞吞噬功能测定1）显微镜检查法2）硝基蓝四氮唑试验3）荧光标记试验3单核-巨噬细胞功能检测1）炭粒廓清试验2）吞噬功能检测38免疫分子基因检测1Southern印迹杂交2斑点印迹杂交3聚合酶链反应（PCR)4原位杂交和原位PCR5荧光定量PCR3940