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巴斯德法国，微生物学家失败的原因：发酵物中混入了杂菌一.培养基微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、蓝藻等酵母菌、霉菌、食用菌等真菌：原生生物：草履虫、变形虫等病毒是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称．关于微生物的类群牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。一、培养基的概念人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质——培养基思考：微生物“吃”什么？一、培养基的成分：微生物生存的环境和营养物质⑴碳源（提供碳元素的物质）无机碳源：有机碳源CO2、碳酸盐自养微生物异养微生物⑵氮源（提供氮元素的物质）无机氮源：有机氮源：：（葡糖糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨等）牛肉膏、蛋白胨等NH4＋、NO3-N2(3).不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容)(5)另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气等的要求。(4).不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐——基本成分（1）按培养基的物理形态分：•液体培养基•半固体培养基•固体培养基一、培养基的种类（2）按培养基的功能分：基础（通用）培养基选择培养基鉴别培养基（3）按培养基的化学成分分：·天然培养基·合成培养基二、无菌技术1.概念无菌技术又称无菌操作，泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。因此，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵•消毒使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。2.消毒与灭菌•灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。•理化因素的作用强度•消灭微生物的数量•芽孢和孢子能否被消灭(1)定义①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。③化学药剂消毒法：用75%酒精等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。④紫外线消毒。⑴.消毒的方法：2.常用的消毒与灭菌的方法①灼烧灭菌②干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。③高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.⑵.灭菌的方法：二、无菌技术（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面思考：1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？思考：2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。练习•细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（）A.接种针、手、培养基B.高压锅、手、接种针C.培养基、手、接种针D.培养基、手、高压锅C变形题•培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是（）①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线消毒⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法A.⑤③②①④⑥B.①②③④⑤⑥C.⑥②③④①⑤D.③④②①⑥⑤A（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：（根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100ML的培养基时，各种的成分的用量）物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.称量三、实验操作思考：该培养基从物理性质分属于哪种？原因？含有几种基本营养成分？牛肉膏提供上述哪几种成分？准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。3.溶化：4.灭菌：5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时，在酒精火焰附近倒平板。注意：溶化后应该调节PH（在灭菌前）思考3①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?②加琼脂的目的是什么?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差作为凝固剂思考4①在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用倒平板:1).培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。四、纯化大肠杆菌微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。（1）.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。学科网将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______在_______旁冷却接种环，并打开棉塞将试管口通过火焰.将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红将平板_____放入培养箱中培养。倒置思考：1、为什么在操作的第一步要灼烧接种环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；思考：2、每次划线之前都要灼烧接种环？每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。思考：3、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。思考：3、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？避免接种环温度太高，杀死菌种思考：4、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。平板划线法的要点接种前，每次划线前及接种后都要灼烧接种环接种环灼烧后等其冷却后再进行划线第二次及其之后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始划线固体培养基：菌落（2）稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中取少量稀释液（不要超过0.1ml）滴加到培养基表面灼烧待酒精燃尽后冷却8～10s涂布将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀思考：1、涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。稀释涂布平板法的要点用移液管吸取液体之前先摇匀所有操作都应在火焰附近进行涂布器从酒精中取出后，要在火焰上将其上的酒精烧掉涂布器要冷却（5—10s）后再进行涂布涂布要均匀，且涂布时可转动培养皿，使菌液均匀分布五.结果分析与评价㈠.培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。㈡.接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。㈢.是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。大肠杆菌的纯化培养分为制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段；实验分为实验组（接种大肠杆菌的培养基）和对照组（未接种大肠杆菌的培养基）。整个实验过程一定要严格消毒灭菌（无菌操作），否则就无法得到纯化的大肠杆菌，导致实验失败。下面可能出现的实验结果及相应的原因分析1.如果对照组未长出菌落，实验组长出颜色形状大小基本一致的菌落说明培养基制备符合要求，灭菌彻底，接种操作（无菌操作达到要求）及培养时符合要求。2.对照组未长出，实验组上出现了其他菌落说明培养基制备符合要求，灭菌彻底，但接种操作未达到要求（无菌操作未达到要求）3.对照组长出菌落说明培养基制备不符合要求，灭菌不彻底六.菌种的保藏：1.临时保藏：将菌种接种到试管固体斜面培养基上，在合适的温度下培养当菌种长成之后，将试管放入4℃的冰箱中保藏，以后每3-6个月都要将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基2.长期保存：菌种易被污染或产生变异甘油管藏1ml甘油（灭菌）＋1ml菌液－20℃的冷冰箱中保存