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喜树碱的提取及其衍生物的应用Extractionofcamptothecineanditsderivatives,andapplications蒲彩蓉20090411310019杨庆先20090411310028目录•概述•理化性质•喜树碱的提取方法•喜树碱类抗癌药的作用原理•几种重要的喜树碱类抗癌物质概述•喜树（Camptotheca）为山茱萸目珙桐科乔木植物，是我国特有的一种高大落叶乔木，广泛分布于长江流域及西南各省。•喜树中主要含喜树碱（camptothecine）、喜树次碱（venoterpine）、10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecine）、10-甲氧基喜树碱（10-methoxycamptothecine）、白桦脂酸（betulicacid）、长春甙内酰胺（vincoside-lactam）等。•1966年美国的MonroeE.wall博士从喜树茎的提取物中分离得到了抗癌活性物质，将其命名为喜树碱（Camptothecine）。•喜树碱属于生物碱类。理化性质•喜树碱的分子式C20H16N2O4，化学名称为：1H一吡喃酮[3，4：6，7]吲哚并[1，2一b]喹啉一3，14(4H，2H)一二酮•喜树碱是淡黄色结晶，一个含喹啉、内酯、内酰胺的五环平面化合物，此五环中仅有一个不对称中心(C20)，其构型为S型。m.p.264～266℃，[α]D40°，不溶于水，可溶于氯仿、乙醇、乙酸、乙酸乙酯等。•没有明显的碱性，属于中性乃至近酸性物质，与一般生物碱试剂无反应，也不能与酸成盐。喜树碱的提取方法•95％乙醇索氏回流法•0.3%NaOH溶液提取法•95％乙醇超声提取法•匀浆提取法•常温冷浸提取法•水浴振荡提取法95％乙醇索氏回流法工艺流程干燥喜树果实粉碎至10~20目注入虹吸量1.6~1.7倍的95%乙醇将样品装入滤纸斗并将开口处封死80℃水浴提取2~4小时取上清液用盐酸调PH为2~3过滤的沉淀用甲醇洗涤2~3次得喜树碱粗品0.3%NaOH溶液提取法工艺流程干燥喜树果实粉碎至10~20目0.3%氢氧化钠液渗漉收集6~8倍液1.5%NaOH浸渍12h装入渗漉桶中搅拌吸附6h用板框过滤机过滤按喜树果实粗粉量0.6%加入活性炭加盐酸搅拌调pH为2~3将吸附的活性炭干燥后用氯仿回流洗脱喜树碱将洗脱液回收氯仿至干膏体加甲醇煮沸溶解膏体冷却至室温喜树碱析出后过滤用甲醇洗涤2~3次干燥得喜树碱粗品95％乙醇超声提取法工艺流程干燥喜树果实粉碎至10~20目将提取液过滤得滤液95%乙醇超声提取2次得提取液将滤液浓缩得浓缩液将浓缩液离心得上清液加盐酸搅拌调pH为2~3过滤得沉淀用甲醇洗涤2~3次得喜树碱粗品三种提取法比较准备阶段准确称取喜树碱标准品5．00mg，以无水乙醇为溶剂，超声波助溶并定容至100mL；准确吸取1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL、6．0mL、7．0mL、8．0mL、9．0mL、10．0mL标准液，分别置于10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀。该标准系列浓度为：5．0、10．0、15．0、20．0、25．0、30．0、35．0、40．0、45．0、50．0mg/L。按照1．3色谱条件进行测定，每个浓度标准液重复进样5次，取色谱峰面积的平均值。根据峰面积(Y)与标准液浓度(X)呈正比的关系确定线性回归方程为：Y=32114X一16995，相关系数R2=0．9985。色谱曲线对照实验•精确称取干燥喜树叶粉42份，每份1．00g，按表l所示的3种提取方法，即索氏回流提取、超声提取和碱法提取，辅以不同的去除杂质的试验方案分别提取喜树碱，高效液相色谱(HPLC)法测定喜树碱含量，每个方案重复3次，每次进样5针，取平均值，筛选出既能有效去除杂质又不影响喜树碱提取率的方案作为本试验的最佳提取方案。结果见表1。比较与分析•通过对14种提取方案(见表1)提取液中的喜树碱含量进行方差分析和Duncan多重比较，结果显示：采用95％乙醇索氏回流法提取的方案l、方案2、方案3和方案4，经HPLC法测定喜树碱含量极显著地高于采用95％乙醇超声提取和0．3％NaOH溶液提取的各方案。•比较采用索氏回流提取的方案1—4可以看出：方案1、方案3中喜树碱含量极显著地高于方案4，方案2与方案1和方案3差异不显著，与方案4在0．05水平差异显著，但在0．01水平差异不显著。即样品未经任何处理的提取方案，与经过温水浸泡或经过石油醚萃取处理的提取方案相比。喜树碱含量差异不显著，但与同时经过温水浸泡和石油醚萃取处理的提取方案相比差异极显著。表明在95％乙醇索氏回流提取过程中采取的去除杂质的方法均不会显著影响样品中喜树碱含量。但若同时采用两种去除杂质的方法则会极显著的降低提取液中的喜树碱含量。结论•索氏回流法操作简便，溶剂消耗量小，对有效成分的提取也比较完全，是实验室常用的提取中药材有效成分的方法，但因提取过程是在高温(高于提取溶剂的沸点)环境下完成，因此，对热敏感物质的提取不宜采用此法。由于喜树碱不溶于水和普通的有机溶剂，对光、热敏感易分解。从理论上讲采用超声提取最好，但本试验通过对3种提取方法的提取液中喜树碱含量进行方差分析和Duncan多重比较，结果显示：95％乙醇索氏回流提取液中喜树碱含量极显著的高于95％乙醇超声提取，95％乙醇超声提取又极显著的高于0．3％NaOH溶液碱法提取。这可能是由于超声提取过程中超声波产生的强烈振荡，不仅会破坏喜树碱的结构，也会加大喜树碱与其他物质接触并发生反应的概率，超声波在加速喜树碱溶解的同时，也加速了喜树碱的分解和向其他物质转变，导致最终提取液中喜树碱含量低于索氏回流提取。另外，在长时间的碱液浸提过程中，由于喜树碱在钠盐中十分不稳定，很容易与其他物质结合生成更稳定的物质，增加了还原为喜树碱的难度，并且喜树碱在酸水中的溶解度极低，因此，提取液中喜树碱含量极显著的低于索氏回流提取和超声提取。•综合考虑到样品中喜树碱的损失量，去除杂质的效果，以及简化实验操作减少误差来源，本实验选用的提取喜树碱的最佳方法为：用95％的乙醇索氏回流提取6h，样品不经温水浸泡和石油醚萃取。喜树碱类抗癌药的作用原理•喜树碱类药物通过抑制DNA拓扑构型异构酶Ⅰ(TopoI)的合成，使DNA链断裂，阻断DNA合成，干扰细胞分裂周期以及使染色体DNA断裂、降解等反应，在机体多种调控蛋白协同作用下，最终导致肿瘤细胞死亡。•拓扑异构酶Ⅰ是生物体内广泛存在的一类必需酶,参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的过程。几种重要的喜树碱类抗癌物质•喜树碱（camptothecin）•10-羟基喜树碱（10–hydroxycamptothecin)•喜树碱-11（CPT-11)•9-二甲氨基-10-羟基喜树碱(topotecan)•9-硝基喜树碱(9-nitrocamptothecin)•9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin）•7-氰基喜树碱(7-cyano-camptothecin)喜树碱•喜树碱主要用于对胃肠道肿瘤的近期疗效较好，但缓解期较短；主要治疗胃、肠、肝、肺、卵巢、膀胱和头颈部癌及急慢性粒细胞性白血病。与其它抗癌药物无交叉耐药性。10-羟基喜树碱•10-羟基喜树碱能抑杀处于增殖期的肿瘤细胞，属于细胞周期特异性药物，主要作用于DNA合成期(即S期)，并对G2期及M期边界有延缓作用。主要用于原发性肝癌、胃癌、头颈部癌、直肠癌及白血病治疗。喜树碱-11•喜树碱－11(CPT-11)是喜树碱的一种半合成衍生物，可以作为一种前体药物。在体内喜树碱－11被迅速转变成它的活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱（SN－38），主要用于治疗卵巢癌及已转移的直肠结肠癌。9-二甲氨基-10-羟基喜树碱•9-二甲氨基-10-羟基喜树是半合成的DNA拓扑异构酶I(TopoI)抑制剂，作用特点是与拓扑异构酶I形成复合物并导致DNA不能正常复制，导致DNA双链损伤，由于哺乳动物不能有效地修复这种DNA损伤，因此抑制细胞增殖。被广泛用于治疗卵巢癌和小细胞肺癌。9-硝基喜树碱•9-硝基喜树碱（9-NC）以TopoI为作用靶点,其内酯环打开,酰基与TopoI中的亲核部分相互作用,与TopoI-DNA断裂复合物可逆结合,形成药物-TopoI-DNA三元复合物,从而稳定了可裂解复合物,使复制不能进行下去,从而使细胞死亡。主要用于治疗直肠结肠癌及卵巢癌，且对胰腺癌效果显著。Thankyou!!