实验一 质粒DNA的提取

实验一质粒DNA的提取1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论实验目的了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法；掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。结构的三大要素：•多克隆位点•选择标记（耐药性，LacZ）•独立的复制单位种类：•质粒•噬菌体•酵母人工染色体（YAC）•反转录病毒载体•表达载体等pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.pET-32cloning/expressionregionVector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET-32a-SmPR10质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH12.5)中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时,在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。4000kb1kb到200kb实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器（二）材料大肠杆菌E.coliDH5α含重组质粒pET-32a-SmPR10（三）试剂1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。2.溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）3.溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制）4.溶液Ⅲ：60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5mlH2O溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。5.氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。6.RNaseA将RNA酶A溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。7.酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇，75%乙醇。实验步骤质粒的提取1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm离心1min，弃上清液。3.加入100lSolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。4.加入200lSolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。5.加入150lSolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。6.15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5mlEppendorf管中，注意所取体积（约400l）。7.加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。8.小心吸取上清液中至一干净的1.5mlEppendorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀，12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。9.小心吸取上清液中至一干净的1.5mlEppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min，4℃离心，15,000rpm，10min。10.弃上清，加1ml75%乙醇漂洗沉淀，4℃离心，10,000rpm，5min。11.去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。12.加入50lTEbuffer，室温振荡溶解质粒DNA。培养细菌使质粒扩增1.挑取琼脂培养板上的单菌落至2mlLB培养液中（含Amp100g/ml)37℃摇荡培养过夜。2.取1ml菌液转接到一个含有100mlLB培养液三角瓶中(含Amp100g/ml）,37℃摇荡培养过夜。37℃振摇过夜37℃振摇过夜Tiangen质粒DNA小量提取试剂盒（实际用）操作过程1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.将1-2ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中，12,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。3.加200l溶液P1（用前检查是否已加入RNaseA），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。4.加200l溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组DNA被打断，注意不要让反应持续超过5分钟。5.加300l溶液P3，立即轻柔颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。6.12,000rpm离心10分钟。如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内液体。8.向吸附柱CP3内加600l漂洗液PW，12,000rpm离心30-60秒，并弃去收集管内废液。9.重复第8步一次。10.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加40l洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。12.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。实验结果及讨论碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。在质粒提取中，质粒DNA与染色体DNA分离的主要依据是什么?