实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白

实验一醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白目的1、掌握电泳的基本原理2、掌握电泳的基本操作原理----电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。不用支持物的利用支持物1）纸电泳2)淀粉凝胶电泳3)琼脂糖凝胶电泳4）醋酸纤维薄膜电泳5）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）影响泳动速度的主要因素1）电场强度：（越大，移动速度越快）常压电泳：100-500V，2-10V/cm高压电泳：500-10000V，20-200V/cm2）溶液的pH值：buffer。8.603）溶液的离子强度：（I越大，速度越慢；缓冲效果越好），0.02-0.2之间。0.073）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。尽量避免有高电渗作用的支持物。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Davis和Ornstein1959年---人血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺（Acr，单体）和N,N′-甲叉双丙烯酰胺（Bis，交联剂）共聚合而成（由过硫酸铵-四乙基乙二胺TEMED系统或核黄素-TEMED系统激发）。分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）SDS：十二烷基硫酸钠CH3（CH2）11OSO3Na，阴离子去污剂，与蛋白质结合，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，破坏蛋白质的二级、三级、四级结构。1）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-；2）SDS破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚基-SDS胶束。SDS是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳作用使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为1.8nm，长轴正比于蛋白质分子量。MW在15200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。logM=a-bRf，Rf为迁移率醋酸纤维薄膜电泳(CAME)以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带。人血清中常见蛋白质的等电点和分子量蛋白质等电点分子量正常参考值（%）清蛋白4.886900057-68α1-球蛋白5.062000001.0-5.7α2-球蛋白5.063000004.9-11.2β-球蛋白5.1290000-1500007-13γ-球蛋白6.85-7.2156000-3000009.8-18.2负极正极γ—球蛋白/β-球蛋白/α2-球蛋白/α1-球蛋白/清蛋白器材1．醋酸纤维薄膜(8X2mm)2．点样器3．染色皿，漂洗器，镊子4．电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽试剂1．巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶解后稀释至1升。2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml操作-准备l．醋酸纤维薄膜(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约20分钟。2．电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边的缓冲液高度要一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖3．点样：将充分浸透(指膜上无白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多缓冲液，粗糙面(无光泽面)用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。操作-----电泳4．加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电。5．连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V。电泳50分钟，断电。6．染色：用镊子取出薄膜条投入染液8分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。7.漂洗:从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。实验报告将薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代表的蛋白质，完成实验报告。(本实验结束后，电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染色液需要回收，漂洗液请倒入废水缸)。本周值日:第一大组