微生物检验.

第二章生理生化试验一、生理生化试验的概念及其类型二、常见的生理生化试验一、生理生化试验的概念及其类型（一）定义指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（二）设计原则在试验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。（三）生理生化试验的类型1.糖（醇）类代谢试验2.氨基酸和蛋白质代谢试验3.有机酸盐和铵盐的利用试验4.呼吸酶类试验5.毒性酶类试验（四）生理生化试验的方法1.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。2.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。3.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。4.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。（五）生理生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。（一）过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理1、2H2O2过氧化氢酶2H2O+O2阳性：气体产生2、过氧化物酶：RH2+H2O2过氧化物酶R+2H2O阳性：细菌变为黑褐色；阴性：不变色。二、常见生理生化试验阳性阴性（二）细胞色素氧化酶试验原理细胞色素C细胞色素氧化酶氧化型细胞色素C+对苯二胺+--奈酚靛酚兰（蓝色）阳性：2分钟内生成蓝色为阳性阴性：无变化。阳性阴性二、常见生理生化试验•阳性：不抑菌，•变混浊••阴性：抑菌（三）氰化钾试验二、常见生理生化试验（四）硝酸盐还原试验原理KNO3还原酶KNO2KNO2+对氨基苯磺酸+-萘胺红色化合物（立刻或数分钟内）（五）糖发酵试验分解糖产酸，PH值下降，使培养基的酸碱指示剂发生变化。阳性：产酸产气阴性阳性阴性阳性二、常见生理生化试验（六）氧化发酵试验（O/F试验）有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧化型；有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型；有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。阳性阴性灭菌琼脂（厌氧）二、常见生理生化试验（七）甲基红（MR）试验和V-P试验1、MR试验原理：一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应2、V-P试验原理一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（试验结果同MR试验）阴性阳性二、常见生理生化试验（八）柠檬酸盐（枸橼酸盐）试验一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。（九）丙二酸钠试验一些微生物可以以丙二酸钠作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。阴性阳性二、常见生理生化试验阴性阳性（十）马尿酸盐试验一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。（十一）葡萄糖铵试验有些细菌可利用铵盐作为唯一氮源，并分解葡萄糖产酸，酸碱指示剂变色，培养基变黄阳性二、常见生理生化试验阳性阴性（十二）明胶液化试验一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。（十三）苯丙氨酸脱氨酶试验一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，可以脱氨生成苯丙酮酸，其与FeCl3反应产生绿色。二、常见生理生化试验阳性阴性阳性阴性（十四）氨基酸脱羧酶试验一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧，产生胺类物质，使培养基变碱，酸碱指示剂变色。（十五）尿素试验一些细菌可以产生尿素酶，使尿素分解产生大量的氨，使培养基变碱，培养基指示剂变色。阳性阴性阳性二、常见生理生化试验阴性对照（十六）靛基质试验（吲哚试验）一些细菌可以分解蛋白胨的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。（十七）ONPG试验（检测-半乳糖苷酶）邻硝基酚----D半乳糖苷-半乳糖苷酶邻硝基酚+--D半乳糖阳性对照阳性二、常见生理生化试验阴性（十八）淀粉酶试验一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖，加入碘不变色。（十九）卵磷脂酶试验一些细菌产生卵磷脂酶，可以分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色的沉淀或浑浊带。接种菌，可产生淀粉酶透明圈乳白色浑浊带二、常见生理生化试验（十九）脱氢酶试验微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四氮唑（TTC)还原，由无色变为红色。（二十）硫化氢试验一些微生物分解含硫氨基酸（胱氨酸或半胱氨酸），产生硫化氢硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑色沉淀，使培养基变黑。阳性二、常见生理生化试验（二十一）动力学试验有鞭毛的细菌在半固体培养基中除了沿穿刺线生长外，在穿刺线周围可见到羽毛状或云雾状浑浊生长。二、常见生理生化试验阳性阴性（二十二）三糖铁试验1、培养基主要成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%硫酸亚铁琼脂培养基摆成高层斜面pH值调到7.4黄pH6指示剂酚红砖红色pH=7(大约）红色pH72、接种（1）斜面划线接种（2）穿刺接种36oC培养18--24小时二、常见生理生化试验3、观察结果（1）乳糖、蔗糖中，至少分解其中的一种，则：斜面：产酸显黄色（阳性）底层：产酸显黄色（阳性）（2）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖，则：斜面：产碱显红色（阴性）底层：产酸显黄色（阳性）（3）三种糖均不能分解，则：斜面：产碱显红色（阴性）底层：产碱显红色（阴性）（4）分解含硫氨基酸产硫化氢，则硫化氢与Fe2+生成黑色沉淀（FeS），培养基变黑（5）分解糖类产气，培养基中有气泡。二、常见生理生化试验一、定义（一）定义菌落总数（aerobicplatecount）是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1g（或1mL）检样中形成菌落的总数。实际上只包括在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌。（二）卫生意义1.可作为判定食品被污染程度的标志；2.可用来观察细菌在食品中繁殖的动态；3.为食品进行卫生学评价提供依据。第一节菌落总数测定二、原理样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在，接种一定量到培养基中，充分混匀。从理论上来说微生物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数。第一节菌落总数测定五、稀释度选择方法（一）根据食品卫生标准选择1.使平板上菌落数落为30～300cfu；2.若落不到30～300cfu，尽量接近30cfu或300cfu；3.使平板上菌落数宁多不少（二）根据对样品污染程度的估计第一节菌落总数测定六、菌落总数测定时的注意事项：1、固体样品应彻底粉碎；2、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质；3、选择好稀释度；4、培养基温度应在46oC，不能过烫，否则易把细菌烫死；5、培养液中接种菌悬液后，应在20min内接种培养基，（时间太长，某些细菌可自动凝集）培养基和菌悬液必须充分浑匀。第一节菌落总数测定第二节大肠菌群计数一、定义大肠菌群系指一群在36oC条件下培养48h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品（目前大多数国标规定）中大肠菌群数系以每100毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。二、选择粪便污染指标菌应具备的条件1、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多；2、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长；3、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和食品中不能发现；4、对氯的低抗力与肠道致病菌相似；5、检验方法比较简单，易于检出。第二节大肠菌群数测定三、大肠菌群数测定的卫生学意义：大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属新鲜粪便中艾希氏菌属占优势。1、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保险系数更大了；2、测定大肠菌群含量表明食品、饮料被粪便污染的程度：如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接表示有肠道致病菌污染的可能性。第二节大肠菌群数测定四、大肠菌群数测定原理二步九管法1.初发酵培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨2复发酵培养基：煌绿乳糖胆盐培养时间：48h第二节大肠菌群数测定结果处理现有国家标准的稀释度选择方法设E为国家标准规定的待检食品大肠菌群指标1.待检食品为液体食品，\如E＜3，加样方法为：原液各10mL分别接种到3管双料LST中，原液各1mL分别接种到3管单料LST中，10-1稀释液各1mL分别接种到3管单料LST中；2.其他所有食品的加样方法为：10-1稀释液各10mL分别接种到3管双料LST中，10-1稀释液各1mL分别接种到3管单料LST中，10-2稀释液各1mL分别接种到3管单料LST中；根据大肠菌群阳性管数,查MPN检索表，报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。经过和标准起草人沟通，此方法标准的单位可以乘以100，最终报出MPN/100g(100mL)。现国标的MPN表与原国标的MPN表的不同点：1，现表里的数字是有小数点的，而原标准对小数点进行了四舍五入的处理。2，现标准的MPN表比原标准的MPN表要简化一些。原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个组合。3，报告单位不同。现报告单位为MPN/g(mL)，而原报告单位是MPN/100g(100mL)。总结：提高大肠菌群检出率的措施：1、小于30的液体样品，取原液10ml、1ml和1：10稀释液1ml接种。2、若小管中无气泡应轻轻振摇试管，若有气泡上升也算产气。第二节大肠菌群数测定