2.2-纳米药物体内输送过程及障碍

纳米药物体内输送过程及障碍1纳米药物体内输送过程为实现肿瘤的精确靶向，NDS需要历经以下5个过程（图1-3），简称CAPIR：静脉注射进入血液循环（Circulation），通过EPR效应蓄积于肿瘤组织（Accumulation），渗透进入肿瘤组织内部（Penetration），被肿瘤细胞摄取内化（Internalization）以及在细胞内释放包载的药物（Release）。由于这5个过程是连贯性的，所以NDS在任何一个过程出现短板都可能导致最终药效的下降。NDS获得精确靶向面临的最大挑战来源于CAPIR各个过程对纳米粒子物理化学性质，包括粒径、表面电荷、表面修饰、药物释放特征等，具有不同的需求，彼此存在矛盾之处。例如，粒径位于100纳米左右的NPs具有较好的EPR效应，可大量富集于肿瘤组织，但难以渗透至肿瘤内部；更小粒径（20nm）的NPs肿瘤组织渗透性好，但循环时间短，易于被体内清除，导致EPR效应差。负电荷且修饰PEG的NPs具有更好的循环稳定性，但不易于被细胞摄取；正电荷无PEG修饰的NPs易于摄取，但也易于被清除。到达肿瘤组织前，NPs应具备良好的缓释效果，减少药物释放；但进入肿瘤细胞后，NPs需要迅速而彻底地释放所包载的药物。为解决上述矛盾，近年来研究者设计了一系列物理化学性质可变的微环境响应型NDS。图1-3NDS体内递送CAPIR过程及每个阶段对NDS性质的要求纳米药物作为一种外源性物质，在体内运输的不同阶段会遇到各种不同的生物屏障及陷阱。纳米药物经静脉注射进入血液后，血浆中的各种蛋白都会吸附到纳米药物表面对其进行标记，从而通过调理作用，被网状内皮系统(RES)和单核巨噬细胞系统(MPS)识别并快速从血液中清除。大量研究表明，表面PEG化、合适的纳米尺寸以及中性偏弱负电性将有助于纳米药物在血液中“隐身”，延长其在血液中的循环时间，为纳米药物通过EPR效应在肿瘤富集提供了可能。纳米药物经EPR效应在肿瘤组织富集之后，肿瘤组织独特的生理病理学特征和纳米药物自身尺寸因素使得其在肿瘤组织的渗透和扩散变得尤其困难，较小的尺寸、微弱的正电荷，以及修饰可高效渗透肿瘤的多肽可增加纳米药物在肿瘤组织的渗透。纳米药物进入细胞大部分要通过细胞的内化作用，而细胞膜是阻止纳米药物进入细胞的天然屏障，正电荷或者具有靶向细胞表面配体的纳米药物表面特性可大大加快细胞对纳米药物的内吞速率。但纳米药物通过内吞作用进入细胞之后，必须能够避开内涵体/溶酶体或者有效从溶酶体中逃逸，以避免药物被溶酶体降解失活或者被外排出细胞外。最后，纳米药物进入细胞之后，所携带的药物要以原药或者活性成分的形式释放出来，释放的快慢和效率对于最后整个纳米药物体系的输送效率的作用也尤为关键。可见，纳米药物输送过程中，应对所遭遇的不同生物屏障所需求的载体性质是不同的，有些甚至是相互矛盾的。比如，表面PEG化能遮蔽MPS系统和RES系统对纳米药物体系的识别，从而延长其在血液中的循环时间(C)，增加了其肿瘤组织的蓄积(R)，但却不利于纳米药物在组织的渗透(P)、细胞内化(I)以及溶酶体逃逸(R)。表面带正电荷可促进细胞对纳米药物体系的整合内吞，促进纳米药物在肿瘤组织的渗透，但在血液循环过程中却很容易被网状内皮系统识别，加速清除速率，同时降低了其在肿瘤组织的聚集。此外，较大的尺寸(～100rim)能使纳米药物在血液中具有较长循环时间，但却不利于组织渗透，较小的尺寸(20nm)能在肿瘤组织高效渗透，但在血液中却会被快速清除。针对这一困境，申有青教授提出了针对药物输送的“2R2SP’理论(图1.2)，为了克服血液、肿瘤、细胞等多重生物屏障，高效输送纳米药物到肿瘤部位，纳米载药体系需要具备以下3个特征：递药、表面活性和组织渗透。递药是指所携带的药物在CAPI过程中不会从纳米制剂中泄露，而进入肿瘤细胞后又能够快速释放(drugRetentionvsRelease，2R)，表面活性是指纳米颗粒在血液循环过程中能避免网状内皮系统吞噬，在肿瘤组织富集后，能与肿瘤细胞表面靶点相互作用，快速进入细胞(surfaceStealthyVSSticky，2S)；最后，纳米药物要能够扩散到肿瘤组织内部(tumorpenetration，P)，也即2R2SP。因此为了获得较高的药物输送效率，需要设计更加动态的策略来调控纳米药物的性质。在药物输送的各个阶段，纳米药物性质针对相应生物屏障做出相应调整,也即“3S”转变(图1.2)：1)稳定性。在CAPI过程中稳定存在，到R过程以不稳定的形式将药物快速释放；2)表面性质。在CAP过程中呈中性、聚乙二醇化、隐藏功能基团，到I过程转变为阳离子、去乙二醇化、暴露功能基团以利于纳米颗粒内吞；3)粒径：在CA过程粒径相对较大，到P过程变小以利于2纳米药物输送瓶颈国内外学者在长循环(C)、肿瘤富集(A)、提高细胞内吞(I)、与胞内释放(R)等方面做了大量工作，但纳米药物在肿瘤组织内的渗透(P)仍是纳米药物输送的瓶颈所在。目前临床使用纳米药物难以在肿瘤组织内渗透(P)、不能到达远离血管特别是乏氧区内的肿瘤细胞完成入胞(I)和胞内释放（R），导致疗效不理想，这也是众多新开发的纳米药物临床实验失败的重要原因。例如，纳米药物盐酸阿霉素脂质体DOXIL能在血液中稳定循环数日，且在肿瘤部位富集了明显高于注射小分子阿霉素对照的药物浓度，但最终的治疗效果却和小分子阿霉素相仿，未能显著改善药物的疗效。研究表明，大量的DOXIL只是富集在肿瘤血管周围，没有进一步渗透扩散到远离血管的肿瘤细胞附近，因而不能完成随后的入胞和细胞内药物释放这两步。此外，PEG修饰的喜树碱治疗局部晚期和转移性胃癌和胃食管交界处腺癌进入临床试验二期，但是发现它也存在类似的缺点：一是它们在肿瘤中的扩散能力很弱，因此在肿瘤内富集后它们只能停留在肿瘤毛细血管周围而不能扩散到达肿瘤组织深处，无法将药物递送到远离血管的肿瘤细胞；二是载体与肿瘤细胞的作用很弱，导致细胞不能有效内吞这些载药系统，细胞内药物浓度太低，从而大大限制了药物发挥药效。因此提高纳米药物在肿瘤组织中的渗透能力(P)，从而使其更好地完成整个CAPIR五步输送过程，是提高纳米药物抗肿瘤疗效的关键。3纳米载药体内输送多重障碍尽管纳米药物经过十几年的发展，己取得了长足进步并且已经有数种基于纳米载体输运体系的纳米药物进入临床治疗，但是纳米药物至今仍无法撼动传统化疗药物在临床使用中的重要地位。目前已经用于临床使用的纳米药物大多的设计和发展都是从对现有药物进行“减毒增效”出发，利用纳米药物在肿瘤部位EPR效应实现肿瘤被动靶向，以富集更多药物在肿瘤组织，同时降低药物使用剂量，减轻药物毒副作用。但是大量的临床试验以及治疗结果表明，许多纳米药物的治疗效果相比于传统小分子药物化疗并未取得显著的增强，这也是导致许多纳米药物在临床试验中最终失败的原因。纳米载体最重要的任务就是如何将抗肿瘤药物尽可能多的从血液中输送到肿瘤细胞中。但是纳米药物作为一种外源性物质，从静脉注射到血液中，直至最后进入肿瘤细胞中必然会遭受包括免疫系统，肿瘤微环境等在内的多重生物屏障，阻碍纳米药物的体内递送，从而导致药效低下。纳米药物进入体内后根据其阶段不同可分为以下主要生物屏障。3.1血液屏障来自多伦多大学的研究者通过对过去近10年超过100篇纳米药物载体的研究论文分析发现，无论是否具有主动靶向能力的纳米药物，仅有不超过注射剂量1%的药物能够达到肿瘤组织，这意味着注射到体内超过99%的药物都被体内各种代谢作用所清除。纳米药物从静脉注射后最先进入的就是血液环境，也是进入生物体内后所面临的第一道生物屏障。首先，纳米药物作为一外源性物质进入血液后，血液中大量的蛋白会结合到纳米颗粒表面，而血液中大量存在的免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞等表面一些特异性的受体可以识别结合在纳米颗粒表面的蛋白，激活相关免疫细胞的吞噬功能，进而通过受体介导的内吞作用吞噬纳米颗粒，最终将其从血液中清除。另外，在肝脏、脾脏以及骨髓中滞留有大量吞噬能力很强的细胞，如肝脏中Kupffer细胞、脾脏和骨髓中的巨噬细胞等构成的网状内皮系统(RES)能够快速清除血液中的外源性的纳米药物。而对于一些小分子外源性物质或者超小尺度的纳米颗粒(一般认为小于5nm)，则在血液循环过程中通过。肾脏中肾小球部位被快速过滤出血液，进而通过尿液排出体外。Figure1．2Biodistributionandclearanceofpolymericnanoparticles．Tissuedefects，stealthproperties，targeting，andthesizeofthenanoparticlesaremajorfactorsaffectingthebiodistributionandclearanceofpolymericnanoparticles．因此，如何避免纳米药物在血液中被快速清除，进而通过EPR效应更多的在肿瘤组织中富集并减少药物在肝脾等脏器中的分布是纳米药物所需要具备的第一项能力。针对于这一科学问题，研究者们做了大量的工作，希望通过对纳米药物载体进行特定的改性以获得上述能力。通过将纳米药物表面修饰上PEG——一种具有十分强亲水能力的聚合物，可以显著降低纳米药物与血清蛋白的结合作用，从而减少体内单核巨噬细胞对纳米药物的摄取。Sadzuko等人的研究结果表明，将脂质体表面PEG化后，脂质体在网状内皮系统的中量能够减少3倍，而在血浆中的含量相比于未PEG化的脂质体则有6倍的提升，表明PEG化纳米药物对于延长血液循环，克服纳米药物血液屏障有着显著的作用。基于这一现象，研究者们也发展了多种表面PEG化的纳米药物并进入临床使用，比如PEG化脂质体包载阿霉素的DOXIL、聚乙二醇．聚乳酸组装成纳米胶束包载紫杉醇的Genexo1-PM等均是将纳米药物表面PEG化的成功典范。另外纳米药物的尺寸、形貌、组分以及表面电势等都会一定程度上影响其在血液中的清除能力。比如Hunter等人通过研究具有不同尺寸的脂质体在肝脏以及肿瘤中的分布发现，100-200nm的脂质体相比于50nm以下或者300nm以上的脂质体在肿瘤中的富集量多达4倍，50nm以下或者300nm以上的脂质体在肝脏中的含量占到总注射剂量的25%，而100nm的脂质体在肝脏中的含量仅占总注射量的10%。Discher等人发现相比于球形的纳米颗粒，蠕虫状的纳米颗粒能够更长时间的在血液中滞留，其血液半衰期长达5天，并且进一步的研究发现蠕虫状的纳米颗粒难以被巨噬细胞有效吞噬，从而获得了长的血液循环能力。Xiao等人发现具有较强正电性或负电性的纳米颗粒均能够大量的结合蛋白，并且被肝脏中Kupffer细胞快速清除；Levchenko等人研究结果表明具有高的电荷的纳米颗粒在体内会被更快速的清除，表面电势约40mV的纳米颗粒在10min之内已经有超过90%被清除，而相同条件下表面电势小于10mV的中性纳米颗粒在体内被清除的比例仅有10%。3.2肿瘤屏障纳米载药系统逃过血液中蛋白及RES的调理作用后通过肿瘤部位的EPR效应（EnhancedPenetrationandRetention，EPR）从具有一定内皮细胞缝隙的血管渗入肿瘤组织。EPR效应的本质在于完整的内皮系统会因为肿瘤生长或炎性过程而破坏，造成200～2000nm不同的间隙。同时随着肿瘤的发生发展，肿瘤部位的血管密度也会发生改变，因而不同种类及不同时期的肿瘤对于纳米载药系统的EPR效应是不同的。然而肝静脉窦内皮也具有150nm左右的缝隙，脾脏则具有200～250nm内皮细胞间隙，因此纳米载药系统也会深入到肝脾中。纳米药物在血液循环中通过肿瘤组织中不完整的肿瘤血管壁溢出血管进入肿瘤组织中，从而实现纳米药物从血液到肿瘤的递送过程。要想实现药物的高效递送，纳米药物载体不仅仅要能够从血管中渗出，还需要扩散到整个肿瘤组织。然而，肿瘤组织独特的生理病理学特征却给纳米药物在肿瘤组织中的渗透和扩散制造了诸多障碍，限制其从血管溢出后进一步分布到整个肿瘤组织中——构成了纳米药