荧光定量PCR在临床医学中的应用

荧光定量PCR在临床医学中的应用内容提要一、基因诊断技术简介二、乙型肝炎的病原检测三、丙型肝炎的病原检测四、性病相关病原体的检测基因诊断技术简介4基因诊断3免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录mRNA翻译蛋白质1形态学诊断2生化诊断概念PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBRGreenI、EVAGreen荧光探针：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon荧光定量PCR技术的优点特异性强：直接扩增病原体的特异DNA或异常基因片段灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断取材范围广：血清、痰液、体液、毛发等多种样本全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染定量准确：利用标准曲线法，采用对数期分析自动化程度高：操作安全，避免人为判断RocheLightCycler荧光定量PCR技术的临床应用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等乙型肝炎的病原检测乙肝病毒Partiallydouble-strandedDNAA(n)附着和侵入？(-)-DNA分泌？mRNAcccDNA的形成？DNApolRT核心包装？HBV移行？外膜装配？HBV的感染过程乙肝如何传染？慢性HBV感染病毒持续6个月未被清除者免疫耐受期：HBV复制活跃免疫清除期非活动或低复制期慢性乙型肝炎HBeAg阳性慢性乙型肝炎HBeAg阴性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化代偿期肝硬化失代偿期肝硬化HBsAg与抗HBsHBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除HBV感染。抗HBs为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。HBsAg和抗HBs同时阴性：即所谓窗口期，此时HBsAg和抗HBs都未产生。HBsAg和抗HBs同时阳性：HBV感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生。或者是亚型感染。为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？窗口期检测试剂不够灵敏隐匿性慢性乙肝（S基因变异）重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）抗HBs阳性就万无一失了吗？单一抗HBs阳性HBVDNA检出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亚型HBV病毒S基因变异如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？提高检测敏感性采用针对变异抗原的检测试剂HBVDNA的检测！HBeAg与抗HBeHBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换。抗HBe阳转后，病毒复制水平低，传染性降低。但长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%～50%仍可检测到HBVDNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。HBeAg与抗HBe共存？处于血清转换过程中野生株与变异株同时存在HBeAg水平与HBVDNA的关系HBeAg阳性标本HBVDNA检出率90％左右HBeAg与HBVDNA有着良好的相关性HBeAg阴性/抗HBe阳性/HBVDNA阳性HBVDNA水平一般较低HBV低水平复制HBV病毒前C区基因变异重叠HCV感染“两对半”缺陷“两对半”是机体的免疫反应状态，为间接指标。“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。HBsAg阴性或HBeAg阴性不能排除HBV感染。HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志。HBVDNA定量对于判断病毒复制程度、传染性大小、病毒药物疗效等有重要意义。HBVDNA拷贝数＝乙肝病毒载量HBVDNA检测的临床意义HBVDNA是HBV存在最直接的依据HBVDNA是HBV复制的标志HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA对乙肝两对半起补充作用HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBVDNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎提供直接证据缩短“窗口期”PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断HBVDNA检测的临床意义HBVDNA检测的临床意义调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBVDNA来决定。HBVDNA检测方法斑点杂交（基本淘汰）定性PCR（基本淘汰）荧光定量PCR（主流）基因芯片（将来？）为什么建议病人要进行HBVDNA检测？荧光定量PCR方法检测HBV感染的各期血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人8.3x108经α干扰素治疗后HBeAg转阴6.2x103非活动性HBsAg携带者血清5.6x103原先血中HBVDNA阳性，已痊愈超过12个月的血清103HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBVDNA很少或缺乏。乙肝的治疗目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50％左右。目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：干扰素：重组人α-1b干扰素、α-2a、α-2b干扰素等。核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。乙肝的治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化等对于HBVDNA≥105的患者应进行抗病毒治疗拉米夫定可迅速降低HBVDNA的浓度，改善肝脏组织的病变，还可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展。尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响。此外拉米夫定还能抑制肝移植受体和AIDS病人体内的HBV复制。拉米夫定治疗人群有明显HBVDNA复制者前C区变异的慢性乙型肝炎代偿期的慢性乙型肝炎接受肝脏移植的患者干扰素治疗失败拉米夫定治疗效果绝大多数患者HBVDNA水平显著下降。用药4周开始下降，12至16周约半数以上的病例血清HBVDNA降到可检测水平以下。治疗1年后HBeAg阴转率约为20%。病毒学应答：HBVDNA低于检测下限血清学应答生化学应答组织学应答应用抗病毒药物后如何判断疗效？应用抗病毒药物后如何判断疗效？治疗结束时完全应答随访1年持续应答无应答YMDD变异YMDD：酪氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸蛋氨酸（M）突变为异亮氨（I）或缬氨酸（V）形成YIDD变异株或YVDD变异株。抗病毒治疗中存在的问题HBV-YMDD变异检测的临床意义动态检测：服用拉米夫定3个月开始，每月检测1次提前发现：可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株及时调整：适时调整用药方案，防止因耐药而导致病情恶化丙型肝炎的病原检测丙肝病毒HCV是单链RNA病毒主要通过血液和血制品传播感染后易转变为慢性肝炎或发展为肝硬化、肝癌呈全球性分布，约1%普通人群感染抗HCVIgM和抗HCVIgGHCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。抗HCVIgM在发病后即可检测到，一般持续1～3个月。如果抗HCVIgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性。低滴度抗HCVIgG提示病毒处于静止状态，高滴度提示病毒复制活跃。HCV抗原检测的困难HCV在血液中含量极低，仅为HBV的1%HCV病毒颗粒很难有效地分离纯化、人工合成抗原丙型肝炎的窗口期很长，血清学检测无法早期诊断抗体持续性存在，无法提示正确的病毒载量HCV的型别复杂，高突变率HCV核心抗原检测试剂盒敏感性差：45.68%HCVRNAHCVRNA阳性是病毒感染和复制的直接标志。HCVRNA的定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。HCVRNA荧光定量PCR检测的临床意义早期诊断：在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者，都可出现HCVRNA阳性，抗HCV阴性的检测结果。弥补ELISA方法的高漏检率,HCVRNA可作为HCV感染诊断的指标。HCVRNA定量可指导用药，为疗效观察及预后判断提供客观指标。抗HCV不能作为抗病毒疗效的指标。慢性丙型肝炎长期抗HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCVRNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度。HCV主要通过输血和血制品传播，对献血员及血制品进行检测，以减少医源性丙型肝炎的发生和传播。核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多！性病相关病原体的检测性病在我国已成为一个重要的公共卫生问题，自99年以来，性病的发生率居高不下，其发病率在传染性疾病中位居第3位，03年我国累计报道性病病例数（HIV除外）73万。浙江省为高发区，位居全国第三。常见性传播疾病病原体淋病双球菌(NG)沙眼衣原体(CT)解脲支原体(UU)人类乳头瘤病毒(HPV)人类免疫缺陷病毒(HIV)淋病双球菌的传统检测方法涂片染色：对于女性患者检出率低，易出现假阴性分离培养：培养较困难，生化鉴定复杂，时间长ELISA抗原检测法：存在交叉反应，非特异反应较严重荧光定量PCR检测NG的优势可在短时间内快速、准确地直接从临床各种标本中检出含量极低的病原菌对女性疑似淋球菌引起的各种炎症的诊断及鉴别诊断起决定性作用对症状轻者或无症状的淋球菌感染者做到早期诊断和鉴别诊断可用于疗效考核沙眼衣原体沙眼衣原体感染与致病近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌在我国，在非淋球菌性尿道炎中居首位泌尿生殖道感染，妨碍妊娠盆腔感染，可致生殖能力损害传统方法检测沙眼衣原体的缺陷“窗口期”检测不出不能判定是现症感染还是既往感染荧光定量PCR检测衣原体的优势灵敏度98%以上、特异性100%提高阳性检出率适用于感染的早期诊断和无症状携带者的检查解脲支原体UU难以分离，需特殊培养基培养，操作费时，需1-3天才能得到初步结果。血清学检查，仅10%UU尿道炎患者在病程中特异性抗体滴度升高4倍，使其方法学应用受限。一些非致病的脲原体或培养过程中的污染都可能导致假阳性的结果。传统方法检测解脲支原体的缺陷具有高度的敏感性和特异性，提高阳性检出率快速、定量准确，可以为临床评价疗效提供依据荧光定量PCR检测支原体的优势CT、UU是美国FDA批准的PCR检测试剂盒，作为首选方法，在临床推广应用人类乳头瘤病毒有100多个型只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主免疫原性低，易形成持续性感染新生儿产道感染HPV宫颈癌传统巴氏涂片漏诊率可达30%从细胞学水平来观察细胞的形态学改变，其中80%的患者确诊时已是宫颈癌晚期传统方法检测HPV的缺陷早期感染的病原检测可对HPV进行分型可以评估