肿瘤个体化分子病理检测和临床应用

肿瘤个体化分子病理检测以及临床应用山东省医学科学院附属医院病理科杨香山肿瘤个体化分子病理检测及临床应用•一、开展肿瘤个体化分子病理检测的意义•二、分子病理检测的标本选择•三、分子病理检测的方法•四、分子病理检测的项目一.开展肿瘤个体化分子检测的意义•--个体化分子诊断是个体化治疗的基石。•--靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计，所以用药前，必需检测患者是否存在对应的靶点，才能发挥其疗效。•卫生部原发性肺癌诊疗规范(2011)-----•--IV期肺癌在开始治疗前，建议先获取肿瘤组织进行表皮生长因子受体(EGFR)是否突变的检测，根据EGFR突变状况制定相应的治疗策略。•中国肿瘤界正在致力于推动肿瘤个体化分子病理诊断的规范化，同时也希望临床能够与病理科紧密配合，共同实现规范化诊断、规范化治疗的目标，以造福患者。•外科手术标本(石蜡切片）10umX2切片•活检标本（石蜡切片）10umX4切片•穿刺标本（新鲜组织）•至少芝麻粒大小•胸腹水标本•不少于10mL。二.分子病理检测的标本选择•--尽量避开肿瘤间质、出血灶、坏死物质等•--肿瘤细胞所占的比例也是必须要考虑的因素。•--目前尚不清楚满足分子学检测需要的最低限度肿瘤细胞的数量。--获得质、量俱佳的肿瘤标本是EGFR检测的重要前提条件，涉及到从临床标本采集到完成最终检测实验等多个环节。--离体后及时（30分钟内）固定于10%中性缓冲福尔马林液中。--固定时间：小标本6-12h，大标本6-48h。肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及病理类型足够的肿瘤细胞比例：测序法，至少50%肿瘤细胞；ARMS法，至少2%的肿瘤细胞(不考虑遗传异质性)足够多的肿瘤细胞总数：200个肿瘤细胞标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞取一张切片H&E染色用于病理评估其余白片用于提取DNA建议切片数量：—手术标本，5µm×5—小活检标本，5µm×10固定包埋组织手术标本：可得足量肿瘤DNA，但DNA片段化小活检标本：可得肿瘤DNA量少且片段化•新鲜/冰冻组织手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤DNA小活检标本：量少，但肿瘤DNA质量仍好肿瘤组织样本的采集及病理评估PirkerR,etal.JThoracOncol2010;5(10):1706-1713.1.Dataonfile.2.KimuraH,etal.BritishJournalofCancer2006;95(10):1390-1395.3.ZhangX,etal.LungCancer2008;60(2):175-182.4.SohJ,etal.IntJCancer2006;119(10):2353-2358.胸水标本处理流程收集胸水50-500ml室温1000转离心10分钟，吸去上清沉淀物-80℃保存沉淀物均匀涂玻片室温晾干涂片涂片区域滴加75%酒精室温晾干涂片常温运输涂片沉淀物用棉絮纸包裹0.1%水性伊红漂染1秒10%中性福尔马林固定24-48小时后续处理与组织标本相同低温保存酒精固定涂片福尔马林固定切片三.分子病理检测的方法•基因试剂盒价格适中、灵敏度，特异性高、所需时间短。PCR通用设备平台•基因芯片特定设备，价格高•测序法检测PCR通用设备平台，灵敏度，特异性低、所需时间长。价格便宜•（一）技术简介•肿瘤个体化治疗是指实施治疗前根据患者的个体差异（基因差异），“量体裁衣”（基因检测）地制定某个患者的治疗方案，即检查某种靶向药物对患者是否有效或是在多种化疗药物中筛选最有效的药物。化疗个体化可显著提高治疗效果，有效缓解疾病，避免药物的毒副作用，提高患者的生活质量，避免因反复尝试不同药物带来的身体损害、错过最佳治疗时间以及浪费金钱。使用靶向药物前必须基因检测，从而判断该药是否适用该患者。荧光定量PCR与基因测序法检测基因突变的比较荧光定量PCR与基因测序法检测基因突变的比较荧光定量PCR检测DNA测序法技术原理特异双环引物探针Sanger双脱氧链终止法灵敏度、特异性可准确检测出含量1%的突变DNA，特异性高突变DNA含量低于20%易产生误差成功率成功率高达100%对石蜡样本检测成功率为70-75%扩增片段长度～100bp≧200bp所需时间模板完成后仅需要90分钟至少1个工作日结果判读简单，只需观察扩增曲线即可需要通过DNA序列分析软件基因检测过程示意图标本采集与运输要求检验标本标本采集与保存标本运输全血5ml,EDTA抗凝管（紫盖），充分混匀，保存低温运输，24小时送达血浆新鲜全血5ml,EDTA抗凝管（紫盖），室温直立静置30分钟，8000rpm离心5分钟，取上清于无菌EP管中，冻存低温运输，24小时送达石蜡包埋组织蜡块或5-10张白片，厚度在5-10um;加同一蜡块HE染色片1张常温运输（20）新鲜组织组织切除后用生理盐水冲洗，无菌管中冻存低温运输，24小时送达新鲜组织组织切除后用生理盐水冲洗，放入福尔马林固定保存常温运输（20）体液脑脊液3-5ml,无菌管保存；胸腹水10ml,注入含106mmol/L酸钠抗凝剂的无菌管（浅蓝色盖），抗凝剂与标本比例1:9低温运输，24小时送达骨髓3-5ml骨髓，EDTA抗凝管（紫盖）低温运输，48小时送达基因突变检测方法----国际肺癌协会共识测序法与ARMS法比较测序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高测序法和ARMS法在不同标本类型中突变率的比较ARMS法更适合用于小标本检测四.分子病理检测的项目•分子靶向治疗基因检测：●药物敏感基因检测：□ERCC1基因表达•EGFR（29种、4种）□P53基因突变（6种突变）•KRAS（7种突变）□BRCA1基因表达•BRAF基因突变（V600E突变）□RRM1基因表达•Jak2基因突变（V617F突变）□TYMS基因表达•PIK3CA基因突变（5种热点突变）□DPD基因表达•C-KIT基因突变（D816V突变）□STMN1基因表达•RET基因突变（M918T突变）□TYMP基因表达•PDGFRA基因突变（D842V突变）□BRCA1基因表达•BCR-ABL基因突变（T315I突变）□TOP2A基因表达•EML4-ALK融合基因（RT-PCR法)□TUBB3基因表达（一）分子靶向药物作用靶点基因检测临床应用癌症种类靶向药物（主要基于NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点非小细胞肺癌易瑞沙、特罗凯EGFRKRASBRAF突变型野生型野生型DNA突变结直肠癌西妥昔单抗、帕尼单抗KRASBRAFEGFR野生型野生型突变型DNA突变胰腺癌厄罗替尼EGFRKRAS突变性野生型DNA突变头颈部癌西妥西单抗KRASBRAF野生型野生型DNA突变黑色素瘤PLX4032,PLX4720BRAF突变型DNA突变胃肠道间质瘤伊马替尼（格列卫）C-kit突变型DNA突变二、分子靶向药物作用靶点检测和耐药基因检测临床应用（二）化疗药物对应的基因检测项目临床应用癌症种类化疗药物（主要基NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点结直肠癌氟类药（如5-氟尿嘧啶、卡培他滨等）TYMSDPD低表达低表达mRNA表达水平铂类药物（如奥沙利铂）ERCC1BRCA1RAP80低表达低表达低表达伊利替康EGFR高表达肝癌铂类药物（如顺铂、奥沙利铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平吉西他滨RRM1低表达氟类药（如5-氟尿嘧啶、卡培他滨等）TYMSDPD低表达低表达蒽环类（如多柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平胆管\胆囊癌铂类药物（如顺铂、奥沙利铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平氟类药（如5-氟尿嘧啶）TYMSDPD低表达低表达吉西他滨RRM1低表达癌症种类化疗药物（主要基NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点胰腺癌铂类药物（如顺铂、奥沙利铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平氟类药（如5-氟尿嘧啶、卡培他滨等）TYMS低表达吉西他滨RRM1低表达肾癌吉西他滨RRM1低表达mRNA表达水平氟类药（如5-氟尿嘧啶、卡培他滨等）TYMS低表达蒽环类（如多柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平前列腺癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类如多西紫杉醇）TUBB3BRCA1低表达高表达依托泊苷TOP2A高表达癌症种类化疗药物（主要基NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点膀胱癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平吉西他滨RRM1低表达抗微管类（如紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱等）TUBB3BRCA1低表达高表达氟类药（如5-氟尿嘧啶等）、培美曲塞TYMS低表达蒽环类（如多柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平乳腺癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类（如紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春瑞滨等）TUBB3BRCA1低表达高表达氟类药（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表达低表达吉西他滨RRM1低表达依托泊苷TOP2A高表达蒽环类（如多柔比星、表柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平癌症种类化疗药物（主要基NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点宫颈癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类（如紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春瑞滨等）TUBB3BRCA1低表达高表达吉西他滨RRM1低表达氟类药（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表达低表达蒽环类（如多柔比星、表柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平卵巢癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类（如紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春瑞滨等）TUBB3BRCA1低表达高表达吉西他滨RRM1低表达卡培他滨、培美曲塞TYMS低表达依托泊苷TOP2A高表达蒽环类（如多柔比星）TOP2A高表达mRNA表达水平癌症种类化疗药物（主要基NCCN2010版）检测基因检测结果检测靶点头颈部癌铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类（如紫杉醇、多西紫杉醇等）TUBB3BRCA1低表达高表达氟类药（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表达低表达吉西他滨RRM1低表达黑色素瘤铂类药物（如顺铂、卡铂）ERCC1BRCA1低表达低表达mRNA表达水平抗微管类（如紫杉醇、长春花碱、长春瑞滨）TUBB3BRCA1低表达低表达吉西他滨RRM1低表达•扩增阻碍突变系统(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)•又称等位基因特异性扩增（Allele-specificamplification，ASA）。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。该法省去了探针杂交操作，通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物。•细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50~300kbp长的DNA大片段，或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder.如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成。•1.大分子染色体DNA片段的测定•细胞凋亡的