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分子诊断与精准医疗北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司精准医疗•2015年3月11日，国家首次精准医学战略专家会议，提出中国精准医疗计划•卫计委表示，将其列入国家“十三五”科技发展重大专项•3月，国家卫计委公布了第一批肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术临床试点单位精确诊断第一步：明确患者的基因突变状态精准医学是精确诊断和靶向治疗的结合什么是分子诊断？•分子诊断（moleculardiagnosis）：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。•包括DNA、RNA和蛋白质•所有疾病(除外伤)的发生均与基因•检测技术：测序(Sequence)原位杂交(Hybridization)聚合酶链式反应(PCR)与遗传有关的DNA结构是由硷基连接而成的双股双螺旋结构。一些硷基片段即为基因基因：DNA的结构当基因丢失，或易位，或插入外来基因即可发生肿瘤免疫监控功能失效—不能识别和清除基因突变的细胞肿瘤药物的发展趋势肿瘤患者的个体差异、肿瘤的异质性决定了单一模式的“OneSizeFitsAll”的粗放医疗时代将被以分子检测手段为基础的个体化医疗所取代。EGFR突变检测的意义•1、吉非替尼-Gefitinib，商品名:易瑞沙-Iressa，2015，FDA批准一线药，生产商:阿斯利康（AstraZeneca）。•2、厄洛替尼-Erlotinib，商品名:特罗凯-Tarceva，2013年，FDA批准一线药，生产商：罗氏（Roche）。•3、埃克替尼-Icotinib，商品名：凯美纳-Conmana，2011，CFDA批准的二线药，生产厂家：贝达药业股份有限公司。•4、19缺失或外显子21(L858R)取代突变，阿法替尼-Afatinib，商品名：Gilotrif，2013，FDA批准的一线药，2015年8月在华上市，生产厂家：德国勃林格殷格翰公司。•5、T790M突变：AZD9291(阿斯利康)，RociletinibEGFR基因突变状态是EGFR酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗晚期NSCLC最重要的疗效预测因子。EGFR信号通路及靶向治疗机制检测靶标检测结果临床意义EGFRE18/19/20/21不突变野生型，肿瘤细胞信号正常转导，特罗凯/易瑞沙/凯美纳/阿法替尼疗效较低突变突变型，阻断肿瘤细胞信号转导，特罗凯/易瑞沙/凯美纳/阿法替尼疗效较高4.肺癌EGFR通路靶向分子病理检测EGFR突变较易发生于亚洲人、女性、腺癌、不吸烟患者。最有效的是E19/E21突变，占总突变90%，E20为耐药突变。EGFR突变患者使用吉非替尼反应率可达到71.2%，而野生型患者只有1.1%。EGFR野生型患者使用吉非替尼死亡风险增加185%。KRASE2(12/13)/3(61)不突变野生型，西妥昔单抗疗效较高突变突变型，西妥昔单抗疗效较低BRAFE15(V600E)不突变野生型，西妥昔单抗疗效较高突变突变型，西妥昔单抗疗效较低PIK3CA(542/545)/(1043/1047)不突变野生型，西妥昔单抗疗效较高突变突变型，西妥昔单抗疗效较低VEGFR1基因表达高贝伐单抗(阿瓦斯汀)疗效较高低贝伐单抗(阿瓦斯汀)疗效较低1.EGFR2.K-RASK-ras信号通路K-RAS基因属Ras基因家族，正常时能调控细胞生长路径；异常时，导致细胞持续生长。K-RAS蛋白是EGFR信号传导中关键下游调节因子。K-RAS基因突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗治疗产生耐药性。K-RAS基因突变检测K-RAS基因突变检测3.B-RAF•BRAF是MAPK的最强激活剂，40多种突变，15外显子1799T/A最常见；•多见于黑色素瘤（突变率40-60%）、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、NSCLC（突变率0.5-4.9%，女性、肺腺癌患者）；4.ALK融合基因•ALK激酶抑制剂：克唑替尼、色瑞替尼EML4-ALK融合基因可见于多种肿瘤，如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神经细胞瘤和NSCLC等；在NSCLC人群中，EML4-ALK阳性率约为3%～7%左右；主要存在于腺癌中、轻度吸烟、年轻男性；33%非EGFR、KRAS突变的NSCLC患者出现EML-4-ALK突变，排他性强；EML4-ALK阳性者并不能从EGFR-TKI靶向治疗中获益，而Crizotinib对EML4-ALK突变型晚期NSCLC患者的疾病控制率可达90%，接受Crizotinib治疗可使患者获得明显的生存获益临床意义：EML4-ALK基因融合或ALK基因断裂呈阳性的患者可以从克唑替尼/色瑞替尼的治疗中获得最大化的生存效益。在克唑替尼上市时，FISH被美国食品药品监督管理局（FDA)批准为EML4-ALK阳性NSCLC的伴随诊断方法，是ALK融合基因检测的金标准。检测靶标检测结果临床意义EML4-ALK基因融合(9种融合类型)不融合基因不融合，克唑替尼的疗效不佳融合基因融合，克唑替尼的疗效较好■关于阳性率：→西方肺腺癌患者EGFR突变阳性率约为10%，亚裔腺癌患者为50%左右，亚裔鳞癌约为2.7%；→不吸烟、女性、肺腺癌患者EGFR突变阳性率更高；→KRAS突变在非亚裔、吸烟及黏液癌中最常见；50%结直肠癌患者中；→EML4-ALK融合阳性率约为3%-11%。■关于互斥性：→EGFR和KRAS突变重叠在肺癌患者的发生率1%；→EML4-ALK融合和EGFR突变大多数情况下不同时存在。5.PIK3CA•PIK3CA是一种癌基因，编码I类磷脂酰肌醇-3激酶的p110催化亚单位，PI3Kp110a；该基因可以发生体细胞突变而致癌的基因。突变热点均能增强PI3K的脂质激酶活性。•已发现多种癌症，如结直肠癌（10－32%）、乳腺癌、非小细胞肺癌等存在PIK3CA基因突变。•PIK3CA存在两个热点突变区：9号外显子（E542K、E545K、E545G突变）；20号外显子（H1047R、H1047L突变）；PIK3CA基因突变导致PI3K/Akt信号通路持续性活化，PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。临床意义检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患者对EGFR-TKI等药物的耐药性，用于临床辅助诊断，为临床医生选择靶向药物提供参考。PIK3CA与K-RAS同时突变，具有很高的耐西妥昔单抗特性。检测靶标检测结果临床意义PIK3CA(E9/20)不突变对EGFR抗体药物疗效好突变对EGFR抗体类药物疗效不好6.KIT和PDGFRaGISTs中KIT基因突变率约为90%，且突变形式多样。主要集中于11号外显子（Lys550-Val560）约占70-80%、9号外显子（Ala502-Tyr503）约占5%-10%。检测靶标检测结果临床意义C-KIT(9/11/13/17)不突变对伊马替尼/舒尼替尼疗效不好突变对伊马替尼/舒尼替尼疗效好不突变对伊马替尼/舒尼替尼疗效不好PDGFRA(12/14/18)突变对伊马替尼/舒尼替尼疗效好临床意义伊马替尼(Glivec，格列卫)是一种特殊的酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可应用于c-Kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GISTs的治疗。检测KIT基因突变对于指导GISTs患者的合理用药，具有重要的参考价值。•靶向治疗提高药物有效性、安全性、减少毒副作用；同时会产生耐药•耐药原发耐药：KRAS获得性耐药：T790M和C-MET•动态监测NSCLC患者（经EGFR-TKI治疗）血浆DNA的EGFR突变状态，由初始检测到实时检测；•三代EGFR-TKIAZD9291，对于EGFR敏感突变和T790M耐药突变的患者均有效；已初步确立临床疗效；•二代ALK抑制剂Alectinib治疗克唑替尼耐药患者，已初见临床疗效；•免疫疗法，MEDI4736、Pembrolizumab、Nivolumab，在NSCLC中显示出有效性；•以C-MET过表达为靶点，克服EGFR-TKI获得性耐药；2015ASCO最新进展7.HER-2基因扩增各肿瘤的分子病理诊断方案13肺癌药物（NCCN2014年V4版）检测靶标检测内容适用样本化疗药物卡铂、顺铂ERCC1、BRCA1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水ERCC1(118)、ERCC2(312)、XRCC1(194/399)、GSTP1(105)基因多态性外周血多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、长春花碱、白蛋白结合型紫杉醇TUBB3、STMN1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水MDR1(2677/3435)基因多态性外周血培美曲塞TYMS、TYMPmRNA表达水平组织、切片、胸腹水TYMS(3’-UTR/5’-UTR)、DPYD(2A/5A/9A)、MTHFR(677/1298)基因多态性外周血吉西他滨RRM1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水RRM1(37)基因多态性外周血依托泊苷TOP2AmRNA表达水平组织、切片、胸腹水伊立替康UGT1A1(*6/*28)基因多态性外周血丝裂霉素NQ01(465/609)基因多态性外周血异环磷酰胺CYP2C9(*3)、CYP2C19(*2/*3)基因多态性外周血靶向药物厄洛替尼、阿法替尼EGFR(E18、E19、E20、E21)、KRAS(E2、E3)基因突变组织、切片、胸腹水西妥昔单抗KRAS(E2、E3)、BRAF(V600E)、PIK3CA(E9、E20)基因突变组织、切片、胸腹水贝伐单抗VEGFR1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水克唑替尼、色瑞替尼EML4-ALK、ROS1基因融合组织、切片、胸腹水ALK(FISH)基因断裂组织、切片、胸腹水C-MET基因扩增组织、切片、胸腹水14.结直肠癌分子诊断项目13结直肠癌分子诊断项目药物（NCCN2015年V2版）检测靶标检测内容适用样本化疗药物奥沙利铂ERCC1、BRCA1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水ERCC1(118)、ERCC2(312)、XRCC1(194/399)、GSTP1(105)基因多态性外周血5-FU、卡培他滨、氟尿嘧啶TYMS、TYMPmRNA表达水平组织、切片、胸腹水TYMS(3’-UTR/5’-UTR)、DPYD(2A/5A/9A)、MTHFR(677/1298)基因多态性外周血伊立替康UGT1A1(*6/*28)基因多态性外周血甲酰四氢叶酸MTHFR(677/1298)、MTRR(66)基因多态性外周血靶向药物贝伐单抗、阿柏西普VEGFR1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水瑞戈菲尼C-KIT(9/11/13/17)、PDGFRα(12/14)、BRAF(V600E)基因突变组织、切片、胸腹水西妥昔单抗、帕尼单抗KRAS(E2、E3)、NRAS、BRAF(V600E)、PIK3CA(E9、E20)基因突变组织、切片、胸腹水乳腺癌分子诊断项目药物（NCCN2014年V3版）检测靶标检测内容适用样本化疗药物卡铂、顺铂ERCC1、BRCA1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水ERCC1(118)、ERCC2(312)、XRCC1(194/399)、GSTP1(105)基因多态性外周血多西他赛、紫杉醇、长春瑞滨、伊沙匹隆、艾日布林TUBB3、STMN1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水MDR1(2677/3435)基因多态性外周血卡培他滨、氟尿嘧啶TYMS、TYMPmRNA表达水平组织、切片、胸腹水TYMS(3’-UTR/5’-UTR)、DPYD(2A/5A/9A)、MTHFR(677/1298)基因多态性外周血吉西他滨RRM1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水RRM1(37)基因多态性外周血表柔比星、阿霉素TOP2AmRNA表达水平组织、切片、胸腹水环磷酰胺CYP2C9(*3)、CYP2C19(*2/*3)基因多态性外周血甲氨蝶呤MTHFR(677/1298)基因多态性外周血靶向药物贝伐单抗VEGFR1mRNA表达水平组织、切片、胸腹水曲妥珠、帕妥珠单抗HER-2(FISH)基因扩增组织、切片、胸腹水PIK3CA(E9、E20)基因