3-4动物微生物--病毒血凝及血凝抑制实验(实验五)

实验五血凝及血凝抑制实验实验目的１血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。２血凝抑制试验：应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒．３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状态。４掌握基本操作技术,了解其实用价值．实验原理血凝素（HA）柱状流感病毒结构模式图刺突：亚型特异性抗原，易变异血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状功能：①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒侵入细胞②凝集多种动物的红细胞（血凝试验）③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体抑制血凝（血凝抑制试验）血凝试验原理血凝素（hemagglutininHA）：由病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。为病毒的红细胞凝集反应或血凝反应。血凝原理血凝抑制原理血凝抑制试验原理病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝集的现象，称为血凝抑制．实验材料器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理盐水实验步骤1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．血凝试验结果判定效价判定：凝集特别显著：“＋＋＋＋”凝集现象次之：“＋＋＋”凝集清楚可见：“＋＋”稍显凝集者：“＋”血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定血凝反应强度示意图“4＋”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3＋”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2＋”红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“＋”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“－”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。血凝抑制1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水。2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡后，室温静止作用5min。4.在1-12孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。5.观测结果，记录实验数据．血凝抑制试验结果判定测定孔RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)凝集（-）病毒对照孔：凝集RBC对照孔：无自凝血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血清稀释度。孔号1234567891011(+)12（-)HA稀释度248163264128256、、、、弃生理盐25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理盐水2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测++++++++++++++++++++++++++--++++_孔号1234567891011(+)12（-)HI稀释度248163264128256、、、、弃生理盐25252525252525252525X25待检血清2525252525252525252525x4HA血凝素2525252525252525252525251%鸡红细胞252525252525252525252525结果预测-----++++++++++++++++++-++++思考题1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应？为什么？2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应?为什么？3、血凝试验中为什么要加补充液？4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？