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第十三章免疫细胞的分离及免疫细胞功能检测及应用2免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来第一节免疫细胞的分离外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒原理：外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～1.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.077±0.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于Ficoll分离液上层。用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞Ficoll分离液２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液１份34%泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血对分离介质的要求：对细胞无毒；等渗；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085大鼠：1.087人：1.075～1.090方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，淋巴细胞占９０％～９５％；操作简便；易于无菌。二、淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱过滤法Percoll分离液法（连续密度梯度离心）利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。1.贴壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液单核单核淋巴细胞注意：B细胞也可粘附利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。2.吸附柱过滤法PBMC洗脱洗脱液淋巴细胞单核细胞DCB细胞T细胞细胞的粘附能力：3.Percoll分离液法Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。死细胞血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞三、T、B细胞和T细胞亚群的分离•磁性微球分离法•荧光激活细胞分离仪分离法1.磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。流式细胞分析仪2.荧光激活细胞分离仪分离法E花环沉降法尼龙毛柱分离法T细胞和B细胞的分离1.E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B细胞T细胞Ficoll液离心溶解红细胞T细胞B细胞2.尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞表面标志）免疫磁珠流式细胞仪分辨率和灵敏度高缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存对保存液的要求：等渗，具pH缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc-199、RPMI1640）。如需短期保存，置4℃放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(-196℃)条件下保存细胞。2.细胞活力测定细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypanblue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面标志检测的意义三、自然杀伤细胞表面标志的检测第二节淋巴细胞标志及亚群分类一、T细胞表面标志及其亚群CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性T细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、B细胞表面标志SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。CD19+CD5-:B2细胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD19（B细胞的标志）CD21CD32(FcRⅡ)CD35（C3b/C4b受体）CD40（成熟B细胞）CD80/86（活化的B细胞）CD19+CD5+:B1细胞CD22和CD23二、B细胞表面标志三、NK细胞表面标志人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。临床常见疾病中的T淋巴细胞的变化小结•外周血单个核细胞的分离•淋巴细胞分离•T细胞亚群分离