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实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳（定量）实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳一、实验目的学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法。二、实验原理细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得4~7μgRNA，每106细胞可获得5~10μgRNA，提取的RNAA260/A280比值一般为1.8~2.0。在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。（注意：TRIzol具有强烈腐蚀作用，小心操作。）三、实验材料、试剂与器材1、细胞（5х106Hela）2、DEPC水溶液，PBS，TAE3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯4、TRIzol试剂购自Invitrogen5、烧杯（1000，500，100，50ml若干），量筒（1000，500，250，50，20ml若干），玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。枪头（1000、200、20ul），离心管(0.2ml、0.5mlPCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管)，枪头盒。四、实验步骤1.RNA提取前的准备1）、玻璃器皿，金属及耐250℃物品的处理：于高温烘箱中干烤，180℃，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。2）、塑料制品的处理：0.05-0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5mlPCR管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性，致癌物，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。3）、试剂的配制：试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃，30分钟高压灭菌。2.RNA的提取(TRIzol法)：安全去除细胞生长介质往细胞培养瓶中加入1mlPBS洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出PBS洗涤液向细胞培养瓶中加入2mlTRIzol，以枪小心吹打，分入2个1.5mlEP管中室温下培育五分钟（使核蛋白复合物充分分离）时间可能更长30min向EP管中加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol，用力摇晃15秒钟，室温培育三分钟12000g，4oC离心15min小心吸取上层无色水样层（0.6ml/mlTRIzol）转移至一新EP管中加入0.5ml/mlTRIzol异丙醇，室温放置15min12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清加入1ml/mlTRIzol75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水55℃加热RNA5-10min（提高RNA溶解度），-70℃保存注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。3、紫外分光光度法检测RNA浓度3、琼脂糖凝胶电泳检测（或RNA定量仪器）1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE备用；3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；4）、电泳5V/cm电泳20min5）、电泳图谱：28s和18s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）一、实验目的通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。二、实验原理逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。其原理是：由总RNA或poly(A)+RNA(mRNA)采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。（一）、反转录酶的选择：1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱；2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。（二）、合成cDNA引物的选择：1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA；2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小；3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。三、实验材料、试剂与器材1．第一链cDNA合成试剂盒（promega公司）2．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM（申能博彩）3．TaqDNA聚合酶（Takara）4、特异引物（Invitrogen合成）5、模板RNA(上次实验提得)四、实验步骤1.cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以promega公司提供的M-MLV试剂盒为例。（1）在pcr管中，加入0.5μlinhibitor（40U/μl），加入总RNA0.5-2μg，在管中加10μMOligo（dT）12-182μl，补充适量的DEPCH2O使总体积达14μl（15μl），轻轻混匀、离心；（2）70℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中，冰浴5min，离心，将液体收至管底，冰浴中加入下列试剂的混合物：10mMdNTPmix1.5μl5×PCRbuffer5μlinhibitor（40U/μl）1μlM-MLV反转录酶1μlDEPC水2.5μlTotal25μl42℃孵育60min。（3）于94℃加热3min以终止反应。（4）-20℃保存备用（第一链反应混合物可在-20℃保存3个月以上）。2.PCR（1）取PCR管，依次加入下列试剂：10×PCRbuffer5μlMgcl22μldNTP(10mM)0.5μl上游引物（10pM）2μl下游引物（10pM）2μl第一链cDNA1μlTaq酶（1u/μl）1μlddH2O11.5μlTotal25μl（2）轻轻混匀，离心；（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。条件：1.94℃5min2.94℃40sec3.60℃40sec4.72℃15sec5.GoTo2,32cycles10.4℃Forever（4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描,检测相对表达量。五、注意事项1．逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解；2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等；4．防止DNA的污染：（1）可采用DNA酶处理RNA样品。（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。二、实验原理琼脂糖（agarose）是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，不吸附被分离的物质，是一种很好的凝胶剂。45℃开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于琼脂糖浓度。DNA分子碱性环境下带负电荷，外加电场作用下，从负极向正极移动，兼具电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，以分出不同区带。EB（溴化乙锭）为扁平状分子，与DNA分子形成EB-DNA复合物，在UV照射下，发射荧光，且荧光强度与DNA质量成正比，以肉眼观察，可检测5ng以上的DNA。（注意：EB分子具有强致癌性，请小心使用。）三、实验材料、试剂与器材质粒DNA、微波炉、电泳仪、微型电泳槽、天能凝胶成像系统、三角瓶（250ml）琼脂糖、50хTAE、6хlodingbuffer、EB母液（0.5mg/ml）四、实验步骤(一)制胶1．选择大小合适的电泳制胶板，选择孔径大小适宜的点样梳，水平而垂直地架在封好的电泳制胶板的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5－1.0mm；2．按被分离DNA分子的大小，确定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.