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翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）第3章细胞生物学研究方法本章主要内容•细胞形态结构的观察方法•细胞及其组分的分析方法•细胞培养与细胞工程•细胞及其生物大分子的动态变化•模式生物与功能基因组的研究第一节细胞形态结构的观察方法•病毒20-200nm•支原体0.1-0.3µm•细菌0.5-5.0µm•动植物细胞20-30µm•活细胞多是无色透明的直径显微镜观察范围肉眼观察范围•肉眼0.2mm•光学显微镜0.2µm•电子显微镜0.2nm•扫描隧道显微镜•样品制备技术分辨率一、光学显微镜(lightmicroscope)•从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具1.目镜2.准焦螺旋3.物镜4.载物台5.反光镜（一）普通复式光学显微镜——组成•由3部分组成：–光学放大系统（目镜与物镜）–照明系统（光源和聚光镜）–镜架及调节系统（一）普通复式光学显微镜——成像•放大的倒立虚像–经物镜形成倒立实像–经目镜进一步放大成虚像（一）普通复式光学显微镜——分辨率•分辨率：显微镜最重要的性能参数•分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离•普通光学显微镜最大分辨率0.2µmλ:光源波长N:介质折射率,空气为1,油为1.4α:物镜镜口角(最大140o,Sinα/2最大0.94)镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。（一）普通复式光学显微镜——样品制备Figure9-10,11aMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)石蜡切片H.E染色（二）相差显微镜和微分干涉显微镜•利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察–A.当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加–B.当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低（二）相差显微镜和微分干涉显微镜•相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差体外培养MDCK细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较（二）相差显微镜和微分干涉显微镜•微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别–分辨率比普通光镜提高了一个数量级–录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程Figure9-9MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)Fourtypesoflightmicroscopy(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy(B)phase-contrastmicroscopy(C)Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy(D)dark-fieldmicroscopyFigure9-8MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。（三）荧光显微镜——基本原理•荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)（三）荧光显微镜——基本原理•光源和光学系统与普通光学显微镜不同•核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头•滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成1.照明方式通常为落射式2.光源为紫外光或其他短波长的光3.有两个特殊的滤光片(发射滤片和阻断滤片)荧光显微镜光路系统（三）荧光显微镜——样品制备•免疫荧光技术•荧光素直接标记技术•绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达•两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（三）荧光显微镜——应用•在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分（四）激光扫描共焦显微镜•以激光为光源•聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像•利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像•分辨率比普通荧光显微镜1.4～1.7倍（四）激光扫描共焦显微镜•可通过“光学切片”叠加后重构出样品的三维结构Figure9-20MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)(二向的)3DImageReconstructionzxyzxyzyy荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）二、电子显微镜透射电镜transmissionelectronmicroscope,TEM扫描电镜scanningelectronmicroscope,SEM（一）透射电子显微镜•电子束作为光源•电磁透镜聚焦•镜筒高度真空•图像通过荧光屏或感光胶片记录1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别Figure9-42(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)光镜电镜光源可见光（300-700nm）电子束紫外光（200nm）分辨率200nm0.2nm透镜玻璃透镜磁透镜真空无要求1.33*10-3—10-5Pa电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50～100千伏时，电子束波长约为0.0053～0.0037纳米2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数•电子显微镜分辨率可达0.2nm•电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率3．电子显微镜的基本构造•电子束照明系统•成像系统•真空系统•记录系统（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像超薄切片技术显示的细胞超微结构•应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)（二）透射电镜制样技术——负染色技术•观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等•重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）•分辨率可达1.5nm左右（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术•包括冰冻断裂与蚀刻复型两步•观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感•样品不需固定包埋冰冻蚀刻电镜照片透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较电镜三维重构与低温电镜技术•电镜三维重构技术•低温电镜技术•电子扫描断层成像技术核孔复合物（三）扫描电镜技术•利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌（三）扫描电镜技术•样品利用CO2临界点干燥法处理•样品观察前喷镀一层金膜•一般扫描电镜的分辨本领仅为3nmFigure9-49(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较注意样品制备技术的差异！三、扫描隧道显微镜•探测微观世界物质表面形貌•利用量子力学中的隧道效应•具有原子尺度的高分辨本领•可以在真空、大气、液体等多种条件下工作•非破坏性测量:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分•差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开差速离心一、用超离心技术分离细胞组分•密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带二、细胞成分的细胞化学显示方法•显色剂与细胞组分中特殊基团的结合•通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应Feulgenstain•特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布•原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiff’sreagent）反应呈紫红色三、特异蛋白抗原的定位与定性•细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现•若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察•为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察（一）免疫荧光技术•直接间接免疫荧光技术（A）•间接免疫荧光技术（B）（二）免疫电镜技术•在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位•免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性•原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置原位杂交技术•光镜水平–同位素标记或荧光素标记的探针•电镜水平–生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合FISH(FluorescentInSituHybridization)五、定量细胞化学分析与细胞分选技术•流式细胞术流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flowcytometer）。应用1.分析细胞中DNA,RNA含量和细胞表面分子含量2.细胞、细胞组分的分选第三节细胞培养与细胞工程一、细胞培养——动物细胞培养•分为原代细胞和传代细胞•细胞系：有限细胞系和连续细胞系•细胞株：•基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞•贴壁培养和悬浮培养动物细胞培养原代细胞1—10代以内的细胞传代细胞在体外培养条件下持续传代培养的细胞接触抑制贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂生长的现象细胞系（Cellline)极少数细胞在传10代后可渡过危机而传下去40-50代次并仍保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制行为有限细胞系永生细胞系：细胞发生了遗传改变(染色体明显改变)，有癌变特点细胞株（Cellstrain)单个细胞增殖而来，所有细胞具有相同的遗传性状.目前实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞人BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PC12嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠一、细胞培养——植物细胞培养•单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株一、细胞培养——植物细胞培养•原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株二、细胞工程（一）细胞融合与单克隆抗体技术•细胞融合–灭活的病毒–化学物质（如PEG）–电融合•同核体（homokaryon）•异核体（heterokaryon）•合核体（synkaryon）单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体的制备（二）显微操作技术与动物的克隆•细胞拆合：胞质体，核体–